Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación
Summary
A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.
Abstract
partículas similares a virus (VLP) y partículas subvirales (SVPs) son un enfoque alternativo para el diseño de vacunas viral que ofrece las ventajas de una mayor seguridad de la biotecnología y la estabilidad en el uso de patógenos vivos. No infecciosas y auto-ensamblaje, las VLP se utilizan para presentar proteínas estructurales como inmunógenos, evitando la necesidad de patógenos vivos o vectores virales recombinantes para la administración de antígenos. En este artículo, nos demuestran las distintas fases de diseño y desarrollo de VLP para futuras aplicaciones en las pruebas con animales preclínicos. El procedimiento incluye las siguientes etapas: selección de antígeno, la expresión de antígeno en la línea celular de elección, la purificación de VLP / SVPs, y cuantificación para la dosificación de antígeno. Demostramos uso de ambas líneas celulares de mamíferos e insectos para la expresión de nuestros antígenos y demostrar cómo las metodologías difieren en el rendimiento. La metodología presentada se puede aplicar a una variedad de patógenos y se puede lograr mediante la sustitución de los antígenos con str inmunogénicauctural proteínas de microorganismos de interés del usuario. VLP y SVP ayudan con la caracterización de antígenos y la selección de los mejores candidatos a vacuna.
Introduction
partículas similares a virus (VLP) son una tecnología aprobada para la vacunación humana. De hecho, algunas de las vacunas más contemporáneamente con licencia, incluyendo el virus del papiloma humano (VPH) y la hepatitis Β (HepΒ) vacunas emplean este enfoque. VLP se forman a partir de proteínas estructurales capaces de auto-ensamblaje. Las partículas ensambladas imitan morfologías virales, pero no pueden infectar o replicarse porque carecen de los genomas virales. VLPs pueden ser expresados y purificados a partir de una serie de sistemas procariotas y eucariotas. Una revisión de la literatura reveló que los diferentes sistemas de expresión se emplean en los porcentajes siguientes: – 28% de bacterias, levaduras – 20%, planta – 9%, insectos – 28%, y de mamíferos – 15% 1. De nota, vacunas contra el VPH a base de proteína de la cápside L1 se producen en levadura (Gardasil) o en un sistema de células de insecto (Cervarix) 2. Vacunas HepΒ, Recombivax y Engerix-Β, también se producen en la levadura, y se componen de HepΒ antígeno de superficie de 3, 4.
Utilizamos sistemas de expresión de células de mamíferos y de insectos para producir VLPs que requieren co-expresión de múltiples proteínas estructurales para el montaje. Nuestro trabajo se centra en el diseño, producción, y las vacunas basadas en VLP de purificación contra los patógenos humanos: virus de la influenza, virus sincitial respiratorio (VSR), el virus del dengue (DENV), y el virus Chikungunya (CHIKV). Nuestros métodos son lo suficientemente flexibles para permitir la co-expresión de las múltiples proteínas estructurales de múltiples plásmidos de expresión, o un solo plásmido de expresión (Figura 1). Anteriormente, hemos producido y purificado H5N1 VLPs ensambla a partir de la co-expresión de plásmidos que codifican hemaglutinina de la gripe (HA), neuraminidasa (NA), y la matriz (M1) en las células 293T de riñón embrionario humano 5,6. Los genes fueron optimizados codón para la expresión en células de mamífero y se clonaron en pTR600, un vector de expresión eucariota que contiene el promotor de citomegalovirus temprano inmediato promotor más INTRON A para iniciar transcRiption de insertos eucariotas y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino para la terminación de la transcripción 7. Un enfoque similar utilizando los tres plásmido co-expresión de HA, NA (Figura 1A) y una proteína de matriz viral alternativa, el VIH Gag p55, se utilizó para la generación de subtipo gripe estacional humana H3N2 VLPs en este estudio y se ha demostrado para generar VLP de tamaño similar como partículas de influenza 8. Aunque las vacunas de la gripe predominantemente provocar anticuerpos anti-HA, la adición de neuraminidasa de la gripe media la actividad de sialidasa para permitir VLP en ciernes a partir de células transfectadas 9 y también presentan objetivos inmunogénicos adicionales. Para producir RSV VLP, también seleccionamos el núcleo sin relación de Gag del VIH para diseñar vacunas prototípicas que presentan glicoproteínas de superficie exclusivamente RSV para demostrar aún más la flexibilidad de la formación de VLP utilizando Gag del VIH, como se ha descrito y caracterizado por microscopía electrónica de 6,10 previamente. Otroshan demostrado previamente que las VLP de la presentación de glicoproteínas del RSV pueden ser ensamblados utilizando diversos componentes virales de virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) 11, y la matriz de influenza 12. secuencias glicoproteína de superficie de larga duración se utilizaron en este estudio para retener conformaciones nativas que pueden ser necesarios para la unión al receptor funcional y ensayo de reconocimiento de anticuerpos a través de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Nuestros ejemplos para el uso de sistemas de expresión de plásmidos individuales para generar partículas son DENV y CHIKV. En el caso de DENV, podemos producir partículas subvirales (SVPs) sin cápside en células 293T de un único plásmido que contiene un casete de expresión / E gen estructural prM 13. El término SVP se utiliza para denotar la falta de una proteína de la cápside del núcleo o en el ensamblaje de las proteínas estructurales virales. CHIK VLPs también se puede producir utilizando un único plásmido que contiene un casete CHIKV gen estructural, la codificación de la cápsida y la envoltura proteínas, o en icélulas NSECT por infectar con un baculovirus recombinante que codifica el mismo casete del gen estructural optimizado para la expresión de células de insecto (Figura 1B – C).
El resultado final de la expresión enfoques analizados anteriormente es la liberación de VLPs en medio de cultivo celular que a continuación se puede purificar a través de ultracentrifugación a través de un cojín de glicerol 20%. En este informe, se presentan métodos para expresar y purificar estas VLP de sistemas de células de mamíferos e insectos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos utilizado las técnicas descritas anteriormente con éxito para expresar y purificar SVPs y VLP compuestas de múltiples proteínas estructurales de diversos patógenos. En general, se utilizan sistemas de expresión de mamífero para generar nuestros VLP. Sin embargo, en nuestras manos, las células derivadas de mamíferos rendimientos VLP CHIK eran bajos. rendimiento VLP CHIK era más robusto cuando se utiliza un sistema de células de insectos baculovirus recombinante. En general, baculovirus de insectos sistem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deseamos reconocer a los miembros anteriores del laboratorio de Ross que han ayudado a optimizar el protocolo para la máxima eficiencia y rendimiento.
Materials
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 mL) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
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