Expression och rening av virusliknande partiklar för Vaccination

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för syntes av virusliknande partiklar med hjälp av antingen baculovirus eller däggdjursexpressionssystem, och ultracentrifuge rening. Detta mycket anpassningsbar metod används för att identifiera virala antigener som vaccin mål på ett säkert och flexibelt sätt.

Abstract

Virusliknande partiklar (VLP) och subvirala partiklar (direktörerna) är ett alternativ till viralt vaccin design som erbjuder fördelarna med ökad biosäkerhet och stabilitet över användningen av levande patogener. Icke-infektiös och självsamlande, VLP används för att presentera strukturella proteiner som immunogener, förbi behovet av levande patogener eller rekombinanta virusvektorer för antigenleverans. I den här artikeln visar vi de olika stadierna av VLP design och utveckling för framtida tillämpningar inom preklinisk djurförsök. Förfarandet innefattar följande steg: val av antigen, uttryck av antigen i cellinje val, rening av VLP / direktörerna och kvantifiering för antigen dosering. Vi visar användning av både däggdjurs- och insektscellinjer för uttryckning av våra antigener och visa hur metoder skiljer sig i utbyte. Den metod som presenteras kan tillämpas på en mängd olika patogener och kan åstadkommas genom att ersätta antigenerna med immunogen structural proteiner av användarens mikroorganismen av intresse. VLP och direktörerna hjälpa till med antigen karakterisering och urval av de bästa vaccinkandidater.

Introduction

Virusliknande partiklar (VLP) är en godkänd teknik för mänsklig vaccination. Faktum är att vissa av de mer contemporarily licensierade vacciner, inklusive humant papillomvirus (HPV) och hepatit Β (HepΒ) vacciner använder detta tillvägagångssätt. VLP bildas av strukturproteiner kan självorganisering. De monterade partiklarna härma virus morfologier, men kan inte infektera eller replikera eftersom de saknar virala genom. VLP kan uttryckas och renas från ett antal prokaryota och eukaryota system. En genomgång av litteraturen visar att olika uttryckssystem används på följande priser: bakterier – 28%, jäst – 20%, växt – 9%, insekt – 28%, och däggdjurs – 15% ^1. Notera är HPV-vacciner baserade på L1 kapsidproteinet produceras i jäst (Gardasil) eller i ett insektscellsystem (Cervarix) ^2. HepΒ vacciner, Recombivax och Engerix-Β, är också produceras i jäst, och är sammansatta av HepΒ ytantigen ³, 4.

Vi använder däggdjurs- och insektscellexpressionssystem för att producera VLP som kräver samexpression av multipla strukturella proteiner för montering. Vårt arbete är inriktat på design, produktion och rening av VLP-baserade vacciner mot humana patogener: influensavirus, respiratoriskt syncytialvirus (RSV), denguevirus (DENV), och chikungunyaen virus (CHIKV). Våra metoder är tillräckligt flexibla för att medge samuttryck av de multipla strukturproteiner från flera expressionsplasmider, eller en enda expressionsplasmid (Figur 1). Tidigare har vi producerat och renat H5N1 VLP sammansatta från samexpression av plasmider som kodar influensa hemagglutinin (HA), neuraminidas (NA), och matrisen (M1) i humana embryonala njur 293T-celler ^5,6. Generna kodon-optimerad för uttryck i däggdjursceller och klonades i pTR600, en eukaryot expressionsvektor innehållande de cytomegalovirus omedelbar-tidig promotor plus intron A för att initiera transcription av eukaryota skär och bovint tillväxthormon polyadenyleringssignal för terminering av transkription ^7. Ett liknande tillvägagångssätt med hjälp av tre-plasmiden samexpression av HA, NA (figur 1A) och en alternativ viral matrisprotein, HIV Gag p55, användes för generering av mänskligt säsongsinfluensa subtyp H3N2 VLP i denna studie och har visat sig generera VLP av liknande storlek som partiklar influensa ^8. Även influensavacciner övervägande framkalla anti-HA-antikroppar, tillsättning av influensa neuraminidas förmedlar sialidasaktivitet att möjliggöra VLP spirande från transfekterade celler ⁹ och även medföra ytterligare immunogena mål. För att producera RSV VLP, vi valde också den obesläktade kärnan av HIV Gag att utforma prototypiska vacciner som uppvisar uteslutande RSV ytglykoproteiner att ytterligare demonstrera flexibiliteten hos VLP bildning med användning av HIV Gag, såsom tidigare beskrivits, och som kännetecknas av elektronmikroskopi ^6,10. andrahar tidigare visat att VLP presenterar RSV glykoproteiner kan monteras med hjälp av olika virala komponenter från Newcastlesjuka-virus (NDV) ^11, och influensa matris ^12. Fullängds ytglykoprotein sekvenser användes i denna studie att behålla nativa konformationer som kan vara nödvändiga för funktionell receptorbindning och antikroppsanalys erkännande genom enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA).

Våra exempel för användning av enstaka plasmid expressionssystem för att generera partiklar är DENV och CHIKV. I fallet med DENV, kan vi producera subvirala partiklar (direktörerna) med ingen kapsid i 293T-celler från en enda plasmid innehållande en prM / E-strukturgenen expressionskassett ^13. Termen SVP används för att beteckna att det saknas en kärna eller kapsidprotein vid montering av virala strukturella proteiner. CHIK VLP kan också framställas med användning av en enda plasmid innehållande en CHIKV strukturell gen kassett, som kodar för kapsid-och höljesproteiner, eller i insect celler genom infektering med ett rekombinant baculovirus som kodar för samma strukturella genkassetten optimerad för insektscelluttryck (Figur 1B – C).

Slutresultatet av uttrycket tillvägagångssätt diskuteras ovan är frisättningen av VLP in i cellodlingsmedium som sedan kan renas via ultracentrifugering genom en glycerolkudde 20%. I denna rapport presenterar vi metoder för att uttrycka och rena dessa VLP från däggdjurs- och insektscellsystem.

Protocol

1. Mammalian Expression System för generering av influensa H3N2 VLP Subklon viral strukturella glykoproteiner hemagglutinin (HA), neuraminidas (NA), och humant immunbristvirus (HIV) Gag p55 i eukaryota expressionsvektorer, såsom tidigare beskrivits pTR600. 7 Amplifiera DNA i kemiskt kompetenta Escherichia coli (t.ex., DH5a) och isolera transfektion-grade plasmid med användning av en plasmid-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Mängden DNA är beroende av avkastninge…

Representative Results

VLP avkastningen var variabel genom virusantigen konstruktion design. I detta protokoll har vi visat användning av insekts- och däggdjursceller för produktion av SVP eller VLP i supernatanten och rening genom ultracentrifugering. Fyra subtyper av DENV prM / E strukturella genuttryck kassetter användes för att konstruera de versioner av DENV direktörerna (avgränsade som 1-4) i tabell 1 och visar ett område mellan 1,1 till 2,6 mg totalt protein i 0,6 ml volymer. F?…

Discussion

Vi har använt den teknik som beskrivs ovan för att framgångsrikt uttrycka och rena direktörerna och VLP sammansatta av flera strukturella proteiner för olika patogener. I allmänhet använder vi däggdjursexpressionssystem för att generera våra VLP. Men i våra händer, som härrör från däggdjur-cell Chik VLP avkastningen var låg. CHIK VLP Utbytet var mer robust när man använder ett rekombinant baculovirus-insektscellsystem. I allmänhet, baculovirus-insektscellsystem ger större mängder av rekombinanta pr…

Materials

Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 mL)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096