ARN Purification de Intracellulairement Grown<em> Listeria monocytogenes</em> Dans les cellules macrophages
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
Bactéries pathogènes intracellulaires ─ bactéries causant des maladies infectieuses et capables de croître et de reproduction des cellules à l' intérieur de l' hôte humain ─ sont un problème de santé majeur dans le monde entier 5. Envahir et se répliquer dans une cellule de mammifère, les agents pathogènes intracellulaires ont acquis des mécanismes et des facteurs de virulence sophistiqués. Bien que ces mécanismes sont essentiels à la capacité de provoquer une maladie, nous savons peu de choses sur leur régulation et de la dynamique. Comme les profils d'expression des gènes de bactéries cultivées dans un milieu liquide ne reflètent pas l'environnement réel dans les cellules hôtes, il y a un besoin croissant de transcriptome analyses de bactéries cultivées dans leurs niches intracellulaires. Ces analyses permettront au déchiffrement des adaptations bactériennes spécifiques déclenchées par l'hôte et aidera à identifier de nouvelles cibles pour la conception thérapeutique. L'analyse du transcriptome de bactéries intracellulairement cultivées est très difficile puisque l'ARN mammifère sont plus nombreux que l'ARN bactérien par aumoins dix fois. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode expérimentale pour isoler l' ARN bactérien de la bactérie Listeria monocytogenes croissance à l' intérieur de cellules macrophages murins. L'ARN extrait peut être utilisé pour étudier des adaptations et des mécanismes intracellulaires de virulence de bactéries pathogènes, par diverses techniques d'analyse de la transcription, tels que la RT-PCR, l'ARN-Seq, puces à ADN et d'autres techniques à base d'hybridation.
L. monocytogenes est l'agent causal de la listériose chez l' homme, une maladie avec des manifestations cliniques ciblant principalement les personnes immunodéprimées, les personnes âgées et les femmes enceintes 6. Il est un pathogène intracellulaire facultatif Gram positif qui envahit un large éventail de cellules de mammifères qui ont été utilisés pendant des décennies comme un modèle dans les interactions hôte-pathogène études 7. Lors de l'invasion, il se trouve d'abord dans une vacuole ou le phagosome (dans le cas des cellules phagocytaires), à partir duquel il doit s'échapper en til accueille cytosol des cellules afin de répliquer. On a montré que plusieurs facteurs de virulence à la médiation du processus d'échappement, essentiellement la hémolysine formant des pores, listériolysine O (LLO) et deux autres phospholipases 8. Dans le cytosol , les bactéries utilisent la machinerie de polymérisation de l' actine hôte pour se propulser sur les filaments d'actine au sein de la cellule et de se propager de cellule à cellule (Figure 1). Tous les principaux facteurs de virulence de L. monocytogenes impliqués dans l' invasion, la survie intracellulaire et la réplication, sont activés par le régulateur de transcription maître de virulence, PrfA. 8-10.
Dans la dernière décennie, plusieurs études menées par nous et d' autres ont des méthodes d'analyse de transcriptome des bactéries intracellulairement cultivées appliquée avec succès à l' intérieur des cellules hôtes 2,11-15. Deux approches principales sont utilisées pour séparer l'ARN bactérien de l'hôte-ARN qui sont basées sur: 1) l'enrichissement sélectif de l'ARN bactérien et 2) l'isolement de l'ARN par diffelyse cellulaire rentiel. La première approche repose sur l' hybridation soustractive d'extraits d'ARN totaux à des molécules d'ARN de mammifères (par exemple en utilisant des kits disponibles dans le commerce) ou la capture sélective de séquences transcrites bactériennes (Scots) 11. La seconde approche est basée sur la lyse différentielle des bactéries et des cellules hôtes, dans lequel les cellules hôtes sont des cellules bactériennes lysées tandis que restent intactes. Les cellules bactériennes sont ensuite séparés du lysat des cellules hôtes, habituellement par centrifugation, et l'ARN est extrait en utilisant des techniques standard. Le principal problème avec cette approche est que, avec des bactéries intactes, des cellules hôtes sont également des noyaux isolés, ainsi les préparations d'ARN contiennent encore l'ARN mammifère. Une façon de surmonter ce problème est de séparer les bactéries intactes à partir des cellules hôtes noyaux par centrifugation différentielle, bien que cette procédure prend généralement du temps soulevant l'inquiétude des changements dans le profil d'expression génique lors de l'extraction. Dans cet article, nous présentons un ba amélioré et rapidecteria protocole d'extraction d'ARN, qui est basée sur la différence de l'approche de lyse cellulaire. Tout d' abord, L. monocytogenes infectées par les cellules macrophages sont lysés avec de l' eau froide. Ensuite, les noyaux macrophage sont éliminés par une brève centrifugation et bactéries intactes sont rapidement collectées sur les filtres, à partir de laquelle l'ARN est isolé par extraction phénol-SDS à chaud des acides nucléiques bactériens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici représente un procédé optimisé pour l' isolement de l' ARN bactérien de L. monocytogenes bactéries en croissance intracellulaire dans les cellules macrophages. Ce protocole est basé sur la lyse différentielle de cellules, et comprend deux grandes étapes d'enrichissement de l'ARN bactérien: macrophage noyaux sédimentation au moyen d'une centrifugation et d'une collecte rapide des bactéries par filtration. Ces étapes sont suivies par un procédé d'…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
Referências
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3’Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
