RNA Purification fra intracellulært Grown<em> Listeria monocytogenes</em> I makrofagceller
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
Intracellulære bakterielle patogener ─ bakterier som forårsaker infeksjonssykdommer og i stand til å vokse og reprodusere inne celler av menneskelige verter ─ er et stort helseproblem over hele verden 5. Å invadere og gjenskape i en pattedyrcelle, har intracellulære patogener kjøpt sofistikerte virulensmekanismer og faktorer. Selv om disse mekanismene er grunnleggende evne til å forårsake sykdom, vet vi lite om deres regulering og dynamikk. Siden genuttrykk profiler av bakterier som dyrkes i flytende media ikke gjenspeiler den faktiske miljøet i vertsceller, er det et økende behov for transkriptomet analyser av bakterier dyrket i sine intracellulære nisjer. Slike analyser vil gjøre det mulig å tyde av spesifikke bakterie tilpasninger utløst av verten, og vil bidra til å identifisere nye mål for terapeutisk design. Transkriptomet analyse av intracellulært dyrket bakterier er svært utfordrende siden pattedyr RNA tallmessig bakteriell RNA ved atminst ti ganger. I dette manuskriptet, beskriver vi en eksperimentell metode for å isolere bakteriell RNA fra Listeria monocytogenes bakterier vokser inni murine makroceller. Det ekstraherte RNA kan brukes til å studere intracellulære tilpasninger og virulensmekanismer av patogene bakterier av forskjellige teknikker for transkripsjon analyse, så som RT-PCR, RNA-Seq, mikromatriser og andre hybridiserings-baserte teknologier.
L. monocytogenes er den utløsende agent for listeriose hos mennesker, en sykdom med kliniske manifestasjoner målgruppe primært immunsupprimerte individer, eldre mennesker og gravide kvinner 6. Den er en Gram-positive fakultativ intracellulær patogen som invaderer et bredt utvalg av pattedyrceller som har blitt brukt i flere tiår som en modell i verts patogen interaksjoner studerer 7. Ved invasjonen, ligger det i utgangspunktet i en vacuole eller en phagosome (i tilfelle av phagocytic celler), som det må flykte inn than vert celle cytosol for å gjenskape. Flere virulensfaktorer har vist seg å megle flukten prosessen, først og fremst poredannende hemolysin, Listeriolysin O (LLO) og to ekstra fosfolipaser 8. I cytosol bakterier bruke verts aktin polymerisasjon maskiner til å drive seg selv på aktin filamenter i cellen og å spre seg fra celle til celle (figur 1). Alle større virulensfaktorer av L. monocytogenes er involvert i invasjon, intracellulær overlevelse og replikasjon, blir aktivert av hoved virulens transkripsjonsregulator, PrfA. 8-10.
I det siste tiåret, flere studier utført av oss og andre har med hell brukt metoder for transkriptomet analyse av intracellulært dyrket bakterier inne vertsceller 2,11-15. To hovedtilnærmingsmåter er brukt til å separere bakterielle RNA fra vert-RNA som er basert på: 1) selektiv anrikning av bakterielle RNA og 2) RNA isolering av differential cellelyse. Den første tilnærmingen er avhengig av subtraktiv hybridisering av total RNA ekstrakter til pattedyr RNA-molekyler (for eksempel ved bruk av kommersielt tilgjengelige kits) eller selektiv fangst av bakterielle transkriberte sekvenser (skotsk) 11. Den andre fremgangsmåten er avhengig av differensiallysering av bakterier og vertsceller, hvori vertscellene blir lyserte mens bakteriecellene er intakte. Bakteriecellene separeres deretter fra verts cellelysat, vanligvis ved sentrifugering, og den RNA blir ekstrahert ved anvendelse av standardteknikker. Hovedproblemet med denne løsning er at sammen med de intakte bakterier, blir vertsceller kjerner også isolert, og dermed RNA-preparatene fremdeles inneholde pattedyr-RNA. En måte å løse dette problemet er å skille intakte bakterier fra vertsceller kjerner ved bruk av differensiell sentrifugering, selv om denne fremgangsmåten vanligvis tar tid å heve bekymring for endringer i genekspresjon profil under ekstraksjonen. I denne artikkelen presenterer vi en bedre og rask bacteria RNA ekstraksjon protokoll, som er basert på celle differensial lyse tilnærming. Først L. monocytogenes infiserte makrofagceller lyseres med kaldt vann. Deretter blir makrofag kjerner fjernes ved en kort sentrifugering og intakte bakterier hurtig oppsamles på filter, hvorfra RNA blir isolert ved anvendelse av varm fenol-SDS-ekstraksjon av bakterielle nukleinsyrer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her representerer en optimalisert fremgangsmåte for isolering av bakterie RNA fra L. monocytogenes bakterier vokser intracellulært i makroceller. Denne protokollen er basert på celle differensiallyse og innbefatter to viktige trinn for anrikning av bakterielle RNA: makrofag kjerner sedimentering ved hjelp av sentrifugering og en hurtig samling av bakterier ved filtrering. Disse trinnene følges av en standard RNA-ekstraksjon prosedyre. Mens denne protokollen beskriver rensing av list…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
Referências
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3’Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
