This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Magt Drosophila genetik i stigende grad anvendes på spørgsmål om hormon-signalering og metabolisme og til udvikling af modeller for human sygdom i denne organisme. Der er behov for følsomme metoder til måling af parametre såsom stofskifte til at drive om fysiologi og sygdom i små dyr såsom bananfluen. Den her beskrevne metode vurderer brændstof oxidation i et lille antal voksne fluer fodret fødevarer, der indeholder spormængder af 14 C-mærket substrater såsom glucose eller fedtsyre. Efter fodringsperioden og eventuelle yderligere eksperimentelle manipulationer, er fluer overført til korte rør udjævnet med mesh, som dernæst anbringes i hætteglas indeholdende KOH-mættede filterpapir at fælder udåndes, radioaktivt mærket CO2 genereret fra oxidation af radiomærkede substrater som kaliumhydrogencarbonat, KHCO3. Denne radiomærkede bicarbonat måles ved scintillationstælling. Dette er aqKVANTITATIV, reproducerbar og enkel tilgang til studiet af brændstof oxidation. Anvendelsen af radioaktivt mærket glukose, fedtsyrer, eller aminosyrer muliggør bestemmelse af bidraget af disse forskellige brændstofkilder til energistofskiftet under forskellige forhold som fodring og fastende og i forskellige genetiske baggrunde. Dette supplerer andre tilgange, der anvendes til at måle in vivo energi metabolisme og bør fremme forståelsen for metabolisk regulering.
Arbejde i modelorganismen Drosophila melanogaster har i høj grad bidraget til forståelsen af genetiske principper, udviklingsprocesser, vækst, aldring, adfærd, immunitet og human sygdom 1,2. Et utal af genetiske og cellebiologiske metoder i Drosophila har drevet fremskridt på disse områder. Imidlertid har studiet af metabolismen hos bananfluen udviklet langsommere, skyldes i vid udstrækning til vanskeligt at måle metaboliske parametre i sådan et lille dyr. Interessen for at bruge Drosophila som en model til at studere humane sygdomme som diabetes og for forståelse bidrag stofskiftet til vækst og forskellige patologier har skubbet feltet at udvikle og tilpasse metaboliske teknikker til denne organisme 3,4.
Pålidelige metoder er nu tilgængelige til måling af en række metaboliske parametre i bananfluen. For eksempel er det ligetil at vurdere fødeindtagelse <sup> 5, niveauer af lagrede triglycerider og glycogen samt cirkulerende hemolymph niveauer af glucose og den væsentligste cirkulerende sukker i gylp, trehalose, som er et disaccharid bestående af to molekyler af glucose 4. Anvendelse af metaboliske sporstoffer har muliggjort studiet af næringsstoffer absorption fra kosten og omdannelsen af absorberede næringsstoffer såsom glukose til opbevaring formularer glykogen og triglycerider 6. Stofskifte kan vurderes i frugt flyve gennem måling af ilt forbrug 7,8 og kuldioxid (CO 2) produktion. Citronsyrecyklus oxiderer to-carbon-enheder, der kan komme ind i cyklen acetyl coenzym A (CoA), som er afledt af metabolisme af kosten og lagrede kulhydrater og fedtsyrer. Hver omdrejning af cyklussen genererer et molekyle hver af GTP (eller ATP) og elektrondonoren FADH 2, tre molekyler af NADH, og to molekyler af affaldsproduktet CO 2. CO 2-produktion kananvendes til at estimere basale stofskifte. Samlet CO 2 produktion kan kvantificeres i Drosophila gennem brug af kommercielt tilgængelige eller håndlavede respirometre 9-10,11.
Målingen af den samlede CO 2 produktion, især når kombineret med måling af O 2 forbrug, giver værdifuld indsigt i hele kroppen energiomsætning. Men idet denne foranstaltning identificerer ikke det næringsstof oxideres for adenosin trifosfat (ATP) produktion. Tre hovedklasser af næringsstoffer kan indtaste citronsyre cyklus efter omdannelse til acetyl CoA: carbohydrater, fedtsyrer og proteiner. Glucose-6-phosphat, der stammer fra kosten glucose eller lagres glycogen, kan omdannes til pyruvat, som decarboxyleres ved pyruvatdehydrogenase til dannelse acetyl CoA. Fordeling af fedtsyrer stammer fra kosten eller fra lagrede triglycerider ved ß-oxidation udbytter acetyl CoA, som så kommer ind i citronsyre cyklus. EndeligEt flertal af aminosyrer kan komme ind i citronsyrecyklen efter omdannelse til pyruvat, acetyl CoA eller citronsyre cyklus mellemprodukter, såsom alpha-ketoglutarat.
Næringsstof-specifikke bidrag til energiomsætning under basal og stimuleret betingelser kan overvåges ved hjælp af radioaktive sporstoffer. Protokollen præsenteres her er indrettet til anvendelse i Drosophila fra en protokol, der bruges til at vurdere oxidation i celler dyrket i kultur 12,13. I denne tilgang, bananfluer fodres 14 C-radioaktivt mærket metaboliske substrater (kulhydrater, fedtsyrer eller aminosyrer) i kosten for en kort (timer) eller lange (dage) puls, ciseleret på umærket mad, og derefter udsat for en kammer, der indeholder kaliumhydroxid (KOH)-mættet filter papir til fældefangst udåndede CO 2 som bikarbonat. Radiomærket bicarbonat kan kvantificeres ved scintillationstælling. Forskelle i radioaktivt mærket-CO 2 produktion mellem eksperimental grupper af fluer kan afspejle brug af forskellige brændsler for ATP produktion i løbet af en forlænget hurtig eller iboende forskelle i brændstof stofskiftet mellem genotyper, for eksempel.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til måling af oxidation af specifikke radioaktivt mærkede substrater i voksen Drosophila melanogaster. Denne teknik er ligetil, kvantitativ, reproducerbar og følsom, og det supplerer eksisterende metoder, der måler den samlede CO 2-produktion og O 2 forbrug, da den kan anvendes til at identificere næringsstof (fer) oxideres til ATP-produktion.
Måling af CO 2 frigives fra oxidationen af specifikke radioaktivt mærkede substrater under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her er komplementær til teknikker, der måler den samlede CO 2-produktion. Samlet CO 2 produktion (V CO2) tillader estimering af stofskifte, og når alt O 2 forbrug (V O2) er kendt, kan stofskiftet beregnes og kilden brændstof til oxidation kan estimeres på grundlag af det respiratoriske ombytningsforhold (V CO2 / V O2 = RER). Hvornårkulhydrater er den eksklusive substrat, RER = 1, men når fedtsyrer er den eksklusive kilde, RER = 0,7, på grund af støkiometrien af reaktionerne fra glucose og lipidoxidation. I mangel af udstyr til måling iltforbrug i Drosophila 14, kan den oxidative brændsel ikke kan identificeres. Men ved mærkning flyver med spormængder af en radioaktiv substrat eller en anden og måle satser for radioaktivt mærket CO 2 produktion, kan man drage konklusioner om muligheden af fluer til at oxidere et givet substrat på forskellige tidspunkter i løbet af en stimulus eller om virkningerne af en given mutation på brændstof oxidation.
Der er en række kritiske trin i denne protokol. For det første bør der udvises forsigtighed ved brug af radioaktive materialer for at undgå spild og forurening af forskningsområder. For det andet, når bedøve fluer under trin 2.1 og 3.4, skal forsøgslederen arbejde hurtigt for at undgå virkninger af langvarig CO 2eksponering på metabolisme og adfærd. En gruppe på 20 fluer kan bedøves og overføres til et nyt hætteglas eller i en flue pod i 20 sekunder eller mindre. Når overført fra en anæstesi apparat til et hætteglas mad, skal hætteglasset hvilede på sin side for at forhindre bedøvede fluer fra at sidde fast på maden overflade. Når fluer fodres radiomærket mad i løbet af flere dage som i trin 2.2, bør forsøgslederen sikre, at fødevaren ikke udtørrer som fluer er følsomme over for dehydrering.
Den fodrede eller fastende tilstand før mærkning, valget af etiketten, længden af mærkning tid, hvor lang tid i gylp pod, og metoden til anæstesi er parametre, der kan udsættes for fejlfinding og modifikation ved brug af denne teknik. Første, fluer underkastes korte mærkning perioder (2 – 3 timer) næppe vil forbruge betydelige mængder af radioaktivt mærket mad, medmindre underkastes en fasteperiode på forhånd. Sekund, valget af etiketten cen indflydelse konklusionerne man er i stand til at trække om metaboliske fænotyper. For eksempel radioaktivt mærket CO 2-produktion fra D- [1- 14C] glucose kan afspejle oxidation gennem citronsyrecyklen eller pentosephosphat shunt, hvorimod radiomærket CO 2-produktion fra D- [6- 14C] glucose afspejler oxidation gennem citronsyre cyklus kun 12,15,16. Fodring fluer med et radioaktivt mærket sporstof for en essentiel aminosyre 17,18 ville være en god strategi til vurdering oxidation af aminosyrer afledt af proteiner. Endelig langvarige mærkning perioder med radiomærket glucose rejser også muligheden for inkorporering af dette forstadium til andre klasser af molekyler, såsom triglycerider 19 og aminosyrer, såsom alanin, som let interconverts med pyruvat. Dette kan vurderes ved måling af radioaktivitet inkorporeret i disse forskellige klasser af molekyler 6. Faktisk kan separate grupper af fluer fodres radiolabeled substrater på samme måde og derefter anvendes til flue pod forsøg eller måling af radiomærke, der er lagret og forbliver i glycogen og triglycerider i bespiste og fastende betingelser 6, f.eks. En anden strategi er at anvende korte mærkning perioder, der sandsynligvis vil afsløre oxidation af radioaktivt mærkede næringsstoffer i kosten selv og ikke storage former af disse næringsstoffer. Tredje er det også muligt, at to grupper af fluer kan have identiske satser af 14 CO 2-produktion i en given mængde tid, men meget forskellige satser i første omgang. Derfor variere mængden af tid, der flyver tilbringer i gylp pod kan være en vigtig parameter til at ændre ved vurderingen fænotypisk variation. Endelig er denne protokol kræver brug af en kort periode CO 2 anæstesi, når de lægger fluer i flue pod apparatet. Det er muligt, at CO 2 anæstesi kan påvirke metabolisk funktion i løbet af fluen pod eksperimentet. En alternativ enMETODE er at bruge kvælstof bedøvelse, der ikke påvirker stofskiftet 20.
Som med enhver teknik, der måler sådan et komplekst system som brændstof oxidation og stofskifte, den her beskrevne metode har begrænsninger. Det første er det muligt, at fluer i forskellige grupper kunne forbruge forskellige mængder af radioaktivt mærket mad og dermed ville gå ind i CO 2 opsamling fase af analysen med forskellige udgangspunkter mængder substrat. Dette kan styres til en vis udstrækning ved at udføre eksperimentet med store prøvestørrelser og ved fodring fluer massevis. For korte mærkning perioder, fluer med lignende blå-farvede modet vil have forbrugt den radioaktive mærkning, og kan fremføres til chase del af forsøget. Mængden af radiomærke tilbage i en gruppe af fluer kan også måles ved afslutningen af eksperimentet og i separate kohorter af fluer efter afslutningen af fodring og indledende chase periode. Andet den aktivitetsniveauet mellemgrupper af fluer i fluen bælg kan variere. Dette skal bestemmes eksperimentelt og tages i betragtning ved fortolkningen af data. For det tredje er denne teknik ikke måle samlede CO 2 produktion, kun produktion fra en bestemt kosten næringsstof eller opbevaring formen (e) af dette næringsstof. Denne protokol er ikke en erstatning for, men i stedet supplerer målinger af VCO 2, fordi det giver anderledes og yderligere oplysninger.
Den her beskrevne metode måles udåndes, radiomærket CO 2, der er et produkt af oxidationen af spormængder af specifikke metaboliske substrater. Ved at variere den anvendte mærkning – glucose, fedtsyre eller aminosyre – man kan designe stadig mere sofistikerede eksperimenter for at vurdere bidragene fra forskellige substrater til metabolisme under forskellige fysiologiske tilstande, såsom sult og på forskellige genetiske baggrunde. Fremtidige anvendelser af denne teknik omfatter måling af metabolism i larver og puppe stadier af udvikling, to etaper i Drosophila livscyklus, der er kendetegnet ved ekstrem opbevaring og fordeling af næringsstoffer, hhv.
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |