This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Kraften i Drosophila genetikk blir i økende grad anvendt på spørsmål om hormon signalering og metabolisme, og for å utvikle modeller av human sykdom i denne organisme. Følsomme metoder for måling av parametere slik som metabolic rates er nødvendig for å drive forståelsen av fysiologi og sykdom hos små dyr som bananflue. Metoden som beskrives her vurderer drivstoff oksydasjon i små antall voksne fluer ble matet mat som inneholder spormengder av 14C-merkede substrater som for eksempel glukose eller fettsyre. Etter at foringsperioden og eventuelle ytterligere eksperimentelle manipulasjoner, er fluer overføres til korte rør avkortet med duker, som deretter blir plassert i glassflasker inneholdende KOH-mettet filtrerpapir som feller utåndet, radiomerket CO 2 genereres fra oksydasjon av radioaktivt merkede substrater som kaliumbikarbonat, KHCO tre. Dette radiomerket bikarbonat ble målt ved scintillasjonstelling. Dette er aqKVANTITATIV, reproduserbar, og enkel metode for studiet av drivstoff oksydasjon. Bruken av radioaktivt merket glukose, fettsyrer, eller aminosyrer som tillater bestemmelse av bidraget fra disse forskjellige drivstoff kilder for energimetabolisme under forskjellige forhold, for eksempel foring og faste og i forskjellige genetiske bakgrunner. Dette utfyller andre tilnærminger som brukes til å måle in vivo energiomsetningen og skal fremme forståelse av metabolsk regulering.
Arbeid i modellorganisme Drosophila melanogaster har bidratt sterkt til forståelsen av genetiske prinsipper, utviklingsprosesser, vekst, aldring, atferd, immunitet og sykdom hos mennesker 1,2. En myriade av genetiske og cellebiologiske tilnærminger i Drosophila har drevet fremgang på disse områdene. Imidlertid har studier av metabolismen i bananflue utviklet saktere, skyldes i stor grad til vansker med å måle metabolske parametre i et så lite dyr. Interessen for å bruke Drosophila som en modell for å studere menneskelige sykdommer som diabetes og for å forstå bidrag av metabolismen til vekst og ulike patologier har presset feltet for å utvikle og tilpasse metabolske teknikker for denne organismen 3,4.
Pålitelige fremgangsmåter er nå tilgjengelige for måling av en rekke metabolske parametre i bananflue. For eksempel, er det enkelt å vurdere matinntak <sopp> 5, nivåer av triglyserider lagret og glykogen samt sirkulerende hemolymfe nivåer av glukose og det viktigste sirkulerende sukker i fly, trehalose, som er et disakkarid som består av to molekyler av glukose 4. Bruk av metabolske tracere har gjort det mulig å studere næringsopptak fra dietten og omdannelsen av absorberte næringsstoffer slik som glukose til lagringsformer glykogen og triglyserider 6. Metabolske priser kan vurderes i frukten fly gjennom måling av oksygenforbruk 7,8 og karbondioksid (CO 2) produksjon. Sitronsyresyklusen oksyderer to-karbon-enheter som kan komme inn i syklusen som acetyl koenzym A (CoA), som er avledet fra metabolismen av kosten og lagret karbohydrater og fettsyrer. Hver omdreining av syklusen genererer ett molekyl hver av GTP (eller ATP) og elektrondonor FADH to, tre molekyler av NADH, og to molekyler av avfallsproduktet CO 2. CO 2 produksjon kanbrukes til å beregne basal metabolic rate. Totale CO 2 produksjonen kan kvantifiseres i Drosophila gjennom bruk av kommersielt tilgjengelige eller håndlagde respirometers 9-10,11.
Målingen av totale CO 2 produksjon, spesielt når kombinert med måling av O 2 forbruk, gir verdifull innsikt i hele kroppen energi metabolisme. Imidlertid dette tiltaket ikke identifiserer næringsstoffet blir oksydert for adenosin trifosfat (ATP). Tre viktige klasser av næringsstoffer kan komme inn i sitronsyresyklusen etter overgang til acetyl CoA: karbohydrater, fettsyrer og proteiner. Glukose-6-fosfat, glukose avledet fra kosten eller lagres glykogen, kan omdannes til pyruvat som blir dekarboksylert ved pyruvat dehydrogenase for dannelse av acetyl CoA. Nedbryting av fettsyrer som stammer fra dietten eller fra lagrede triglyserider med ß-oksidasjons utbytter acetyl-CoA som deretter kommer inn i sitronsyresyklusen. EndeligEt flertall av aminosyrer som kan komme inn i sitronsyresyklusen følgende omdannelse til pyruvat, acetyl-CoA eller sitronsyresyklusen mellomprodukter så som alfa-ketoglutarat.
Nutrient-spesifikk bidrag til energiomsetning under basal og stimulert betingelser kan overvåkes ved bruk av radioaktive tracere. Protokollen som presenteres her er tilpasset for bruk i Drosophila fra en protokoll som brukes for å vurdere oksydasjon i celler dyrket i kultur 12,13. I denne tilnærmingen, fruktfluer er matet 14 C-radioaktivt merket metabolske substrater (karbohydrater, fettsyrer eller aminosyrer) i dietten for en kort (timer) eller lengre (dager) puls, renset på umerket mat, og deretter utsatt for en kammer som inneholder kaliumhydroksid (KOH) mettet filterpapir for fangst utåndet CO 2 som bikarbonat. Radiomerket bikarbonat kan kvantifiseres ved scintillasjonstelling. Forskjeller i radiomerket-CO 2 produksjon mellom eksperimental grupper av fluer kan reflektere bruk av ulike brensel for ATP produksjon i løpet av en langvarig rask eller iboende forskjeller i drivstoff stoffskiftet mellom genotyper, for eksempel.
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å måle den spesifikke oksydasjon av radioaktivt merkede substrater i voksen Drosophila melanogaster. Denne teknikken er grei, kvantitativ, reproduserbar og følsom, og det utfyller eksisterende metoder som måler total CO 2-produksjon og O 2 forbruk, fordi den kan brukes til å identifisere den næringsstoff (er) blir oksidert for ATP produksjon.
Måling av CO 2 frigjøres fra oksydasjon av spesifikke radioaktivt merkede substrater ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet her er komplementær til teknikker som måler total CO 2 produksjon. Totale CO 2 produksjon (V CO2) tillater estimering av metabolic rate, og når total O 2 forbruk (V O2) er kjent, kan metabolic rate beregnes og drivstoff kilde for oksidasjon kan estimeres basert på luft bytteforhold (V CO2 / V O2 = RER). Nårkarbohydrater er den eksklusive substratet, RER = 1, men når fettsyrer er den eksklusive kilde, RER = 0,7, på grunn av støkiometrien av reaksjoner av glukose og fettoksidasjon. I fravær av utstyr for å måle oksygenforbruk i Drosophila 14, kan den oksidative brennstoffkilde ikke bli identifisert. Men ved merking flyr med spormengder av en radioaktiv substrat eller en annen og måle forekomst av radiomerket CO 2 produksjon, kan man trekke konklusjoner om muligheten av fluer til å oksidere et gitt substrat ved ulike tidspunkt i løpet av en stimulus eller om virkningene av en gitt mutasjon på drivstoff oksidasjon.
Det finnes en rekke kritiske trinn i denne protokollen. Først bør man være forsiktig ved bruk av radioaktive materialer for å unngå søl og forurensning av forskningsområder. For det andre, når bedøvelse fluene i løpet av trinn 2.1 og 3.4, bør experimenter arbeide raskt for å unngå virkningene av langvarig CO paraeksponering på stoffskiftet og atferd. En gruppe på 20 fluer kan bedøves og overført til en ny beholder, eller til en flue pod i 20 sek eller mindre. Når overført fra en anestesiapparat til en mat hetteglass, skal hetteglasset hvilte på sin side for å hindre bedøvede fluer fra å bli sittende fast på maten overflaten. Når fluene er lei radiomerket mat i løpet av flere dager som i trinn 2.2, bør eksperimentator sikre at maten ikke tørker ut som fluer er følsom for dehydrering.
Matet eller fastet tilstand før merking, valg av etiketten, lengden av merking tid, lengden av tid i flue pod, og fremgangsmåten for anestesi er parametere som kan utsettes for feilsøking og modifikasjon ved bruk av denne teknikken. Først flyr utsatt for korte merking perioder (2-3 t) er usannsynlig å konsumere betydelige mengder radiomerket mat med mindre utsatt for en fasteperiode på forhånd. For det andre, valg av etiketten cen innvirkning konklusjonene man er i stand til å trekke om metabolske fenotyper. For eksempel, radiomerket CO 2 produksjon fra D- [1- 14C] -glukose kan reflektere oksydasjon gjennom sitronsyresyklusen eller pentose-fosfat shunt, mens det radiomerkede CO 2 produksjon fra D- [6- 14C] -glukose reflekterer oksydasjon inn i sitronsyresyklusen bare 12,15,16. Fôring fluer med en radiomerket tracer for en essensiell aminosyre 17,18 ville være en god strategi for å vurdere oksidasjon av aminosyrer som stammer fra proteiner. Til slutt, lange perioder merking med radioaktivt merket glukose også øke muligheten for inkorporering av denne forløper inn i andre klasser av molekyler slik som triglyserider 19 og aminosyrer slik som alanin, som lett interconverts med pyruvat. Dette kan bli vurdert ved å måle radioaktivitet inkorporert i disse forskjellige klasser av molekyler 6. Faktisk kan separate årskull av fluer mates radiolabeled substrater på samme måte, og deretter anvendt for flue pod eksperimenter eller måling av radiomarkør som er lagret og forblir i glykogen og triglyserider i foret og fastende betingelser 6, for eksempel. En annen strategi er å bruke kort-merking perioder som er sannsynlig å avsløre oksidasjon av radiomerkede kosttilskudd næringsstoffer seg selv og ikke lagrings former av disse næringsstoffene. For det tredje er det også mulig at to grupper av fluer kan ha identiske priser av 14 CO 2 produksjon over en gitt tidsperiode, men svært ulike priser i utgangspunktet. Derfor varierende hvor mye tid som flyr tilbringe i flue pod kan være en viktig parameter for å endre ved vurdering av fenotypisk variasjon. Endelig krever denne protokoll for anvendelse av en kort periode på CO 2 anestesi ved å sette fluer i fly pod apparat. Det er mulig at CO 2 anestesi kan påvirke metabolske funksjon i løpet av flua pod eksperiment. En alternativ enpproach er å bruke nitrogen narkose som ikke påvirker metabolic rate 20.
Som med en hvilken som helst teknikk som måler et slikt komplekst system som brensel oksidasjon og metabolske rate, idet fremgangsmåten som er beskrevet her har begrensninger. For det første er det mulig at fluer i forskjellige grupper kan inntar forskjellige mengder av radiomerket mat og dermed ville gå inn i CO 2 samling fasen av analysen med forskjellige utgangsmengder av substratet. Dette kan styres for til en viss grad ved å utføre eksperimentet med store utvalgsstørrelser og ved å mate fluer en masse. For korte merking perioder, fluer med liknende blå-farget guts vil ha konsumert radiomerkingen og kan fremføres til forfølgelse del av forsøket. Mengden av radiomarkør som er igjen i en gruppe av fluer kan også måles ved slutten av forsøket, og i separate kullet fluer etter enden av mate og innledende chase periode. For det andre, aktivitetsnivå mellomgrupper av fluer i flue pods kan variere. Dette må bestemmes eksperimentelt og tas i betraktning ved tolkning av data. For det tredje tillater denne teknikken ikke måle total CO 2 produksjon, bare produksjonen fra en bestemt næringsstoff eller lagring form (er) av det næringsstoffet. Denne protokollen er ikke en erstatning for, men i stedet er komplementær til målinger av VCO 2 fordi det gir annerledes og mer informasjon.
Metoden som beskrives her måler pustes ut, ble radiomerket CO 2 som er et produkt av oksydasjonen av spormengder av bestemte metabolske substrater. Ved å variere den anvendte markør – glukose, fettsyre, eller aminosyre – man kan utforme stadig mer sofistikerte eksperimenter for å vurdere bidragene fra forskjellige substrater til forbrenningen under forskjellige fysiologiske tilstander som sult og på forskjellige genetiske bakgrunner. Fremtidige anvendelser av denne teknikken omfatter måling av metabolism på larve og pupal stadier av utviklingen, to stadier av Drosophila livssyklus som er preget av ekstrem nærings lagring og sammenbrudd, henholdsvis.
The authors have nothing to disclose.
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |