बनाने जेल की मदद से पुनर्जलपूरण का प्रयोग विशाल आकार Polymersomes
Summary
We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.
Abstract
Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).
Introduction
सिंथेटिक कोशिका के आकार, विशाल unilamellar पुटिकाओं (GUVs) का निर्माण अलग सेलुलर प्रक्रियाओं की इन विट्रो पुनर्निर्माण में दिलचस्पी बढ़ रही है एक कृत्रिम कोशिका की तरह प्रणाली 1,2 की पीढ़ी के लिए एक रूपरेखा बनाने के लिए की है। जबकि लिपिड झिल्ली की रचना GUVs प्राकृतिक, जैविक झिल्लियों के उत्कृष्ट mimics हैं, वे पर्यावरण के उतार चढ़ाव के खिलाफ अस्थिर कर रहे हैं और एक काफी कम शैल्फ जीवन है। इन सीमाओं के कारण, amphiphilic copolymers ब्लॉक बहुलक पुटिकाओं, या polymersomes फार्म के लिए लिपिड mimics के रूप में इस्तेमाल किया गया है। 8 – इस संदर्भ में, polymersomes उनकी वृद्धि की स्थिरता 3, रासायनिक बहुमुखी प्रतिभा 4,5 और परिवर्तनीय शारीरिक लक्षण 6 के कारण biomimetic सेल प्रणाली के विकास में फायदेमंद हैं।
मौजूदा तरीकों के लिए फार्म का विशाल आकार polymersomes शामिल electroformation 9 और templated पुनर्जलीकरण 10, w के दोनोंhich समय लेने वाली है, श्रम प्रधान, आवश्यकता होती है विशेष उपकरण हैं और बरकरार विशाल polymersomes की कम पैदावार का उत्पादन। एक साधारण जेल की मदद से पुनर्जलीकरण विधि हाल ही में लिपिड GUVs 11 के उत्पादन के लिए विकसित किया गया था। यहाँ, हम अलग-अलग बहुलक रचनाओं के साथ विशाल polymersomes, नियंत्रित आकार, और विभिन्न बफर रचनाओं में बनाने के लिए जेल की मदद से पुनर्जलीकरण तकनीक पर आधारित एक फिल्म का वर्णन है।
संक्षेप में, 1% w / मानक डीएनए जेल वैद्युतकणसंचलन agarose फिल्मों वी एक गिलास coverslip पर निर्जलित हैं। पॉलिमर क्लोरोफॉर्म में तैयार समाधान तो सूखे चूर्ण agarose फिल्म भर में फैल गया है और लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति दी जाती है। पूरा विलायक हटाने के बाद, बहुलक फिल्मों मध्यम हीटिंग (40-70 डिग्री सेल्सियस) और विशाल (> 4 माइक्रोन) आकार polymersomes 30 मिनट के भीतर का गठन कर रहे हैं के साथ चुनाव के बफर में rehydrated रहे हैं। इस विधि को तेजी से पूरी तरह से बरकरार है, अच्छी तरह से बनाई polymersomes के सैकड़ों मानक प्रयोगशाला के उपकरण और reagen का उपयोग कर उत्पादन करता हैकम से कम कीमत पर टीएस।
चित्रा 1. योजनाबद्ध जेल की मदद से पुनर्जलीकरण विधि का चित्रण है। एक diblock copolymer की रचना की विशालकाय polymersomes पुनर्जलीकरण की ~ 30 मिनट के बाद बनते हैं। हाइड्रोफिलिक ब्लॉक मैजेंटा में चिह्नित है और हाइड्रोफोबिक ब्लॉक हरे रंग में चिह्नित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
Polymersomes व्यापक रूप से जैविक झिल्ली mimics के रूप में पता लगाया जा रहा है। पॉलिमर के मजबूत और बहुमुखी गुण उन्हें व्यापक रूप से झिल्ली functionalization, दीर्घायु और देखते जवाबदेही की आवश्यकता होती है पढ़ाई के लिए आकर्षक बनाते हैं। विशाल आकार polymersomes 9,10 (> 4 माइक्रोन) के गठन के लिए पारंपरिक तरीकों श्रम प्रधान हैं और महंगी और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। यहाँ, हम पहली बार, मानक सस्ती प्रयोगशाला अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग कर विशाल आकार polymersomes के गठन के लिए एक तेजी से, बहुमुखी और मजबूत विधि के लिए उपस्थित थे।
जेल की मदद से पुनर्जलीकरण का प्रयोग, unilamellar polymersomes तेजी से गठन किया जा सकता है (<30 मिनट), पुनर्जलीकरण समाधान (सेल संस्कृति मीडिया सहित) की एक किस्म में और विभिन्न पॉलिमर की एक किस्म के साथ (नहीं दिखाया डेटा)। multilamellar या विषम पुटिकाओं के गठन इस तकनीक का उपयोग नहीं मनाया गया। बी पाली (- इस काम के दौरान, हम पाली (एथिलीन ऑक्साइड) का इस्तेमाल कियाbutadiene) (पीईओ-प्रवासी भारतीय दिवस, ईओ 22 -BD 37) तटस्थ diblock copolymer। कई अलग अलग बहुलक रचनाओं (आरोप लगाया diblock copolymers सहित) अच्छी तरह से इस विधि (नहीं दिखाया गया है) का उपयोग कर काम करते हैं। हालांकि, कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध triblock copolymers और उच्च आणविक भार diblock सहपॉलिमरों (~> 5000 Daltons) अलग polymersomes फार्म नहीं है। इस पांडुलिपि में प्रयोगों के सभी के लिए, लेबल लिपिड की एक कम एकाग्रता दृश्य प्रयोजनों के लिए ही बहुलक समाधान में डाल दिया गया था। दृश्य के लिए अन्य तरीकों, पॉलिमर सीधे एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ क्रियाशील सहित भी इस्तेमाल किया जा सकता है। Polymersomes इसी तरह, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया जा सकता है, हालांकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अधिक से अधिक संकल्प प्रदान करता है।
प्रोटोकॉल के अधिकांश आम तौर पर मामूली संशोधनों के परिणाम को बदल नहीं है। उदाहरण के लिए, बहुलक समाधान coverslips पर फैल की एकाग्रता में छोटे मतभेदों बहुलक एफ के गठन को बदल नहीं हैइल्म का गठन किया। जबकि पूरा एकाग्रता रेंज निर्धारित नहीं किया गया था, polymersome गठन सफलतापूर्वक बहुलक फिल्म सांद्रता (जैसे, 1-10 मिलीग्राम / एमएल) की एक बड़ी रेंज के साथ हो जाएगा। हालांकि, वहाँ कुछ प्रोटोकॉल परिवर्तन है कि नकारात्मक polymersome गठन को प्रभावित कर रहे हैं। सबसे उल्लेखनीय polymersomes के बहुत गरीब गठन में उस दौर कांच coverslips (वर्ग) के बजाय परिणाम है। हम बहुत भी कांच जो वास्तव में polymersomes के गठन hinders पर agarose की कोट करने के लिए इस विशेषता।
इस तकनीक की सबसे उल्लेखनीय चुनौतियों में से एक एक उच्च उपज के साथ सतह से polymersomes ठीक करने की क्षमता है। वहाँ कुछ मामलों में जो मूल सतह से polymersomes हटाने फायदेमंद हो सकता है। निर्जलित बहुलक फिल्म से उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, व्यक्तिगत polymersomes हटाने और उन्हें पालन coverslips साफ करने के लिए इमेजिंग गुणवत्ता और लक्षण वर्णन में वृद्धि होगी (गड्ड के कारणFRAP विश्लेषण के दौरान cularly)। एक विंदुक टिप, जिसमें अंत कट गया है सतह से polymersomes desorb होगा (हालांकि बरामद पुटिकाओं की संख्या मूल का गठन उन लोगों की तुलना में काफी कम है) के साथ इस, कोमल pipetting ऐसा करने के लिए। Polymersomes पर फिर संशोधित coverslip सतहों रखा जा सकता है, polymersome नई coverslip के साथ बातचीत करने की इजाजत दी। आमतौर पर, तटस्थ पीईओ-पीबीडी polymersomes के लिए, ओजोन के साथ इलाज coverslips 15 मिनट के लिए polymersomes इमेजिंग के लिए सतह से नीचे गिर करने के लिए अनुमति देते हैं। विभिन्न सतह संशोधन अलग polymersome रचनाओं (जैसे, नकारात्मक या सकारात्मक पॉलिमर चार्ज) के लिए आवश्यक है।
अधिकांश इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सामग्री सफलतापूर्वक संग्रहीत और सप्ताह के दिनों के लिए उपयोग किया जाता है। जम agarose reboiled और पुन: उपयोग किया जब तक agarose उबलते के बाद भी समुच्चय है शुरू होता है, या जम agarose सूखी शुरू होता जा सकता है। सूखे agarose फिल्मों के साथ coverslips संग्रहित किया जा सकता है और उपयोगअनिश्चित काल के लिए डी (जैसे, महीने)। बहुलक क्लोरोफॉर्म में भंग कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एक बार जब बहुलक फिल्म agarose फिल्मों पर सूख जाता है, हालांकि, फिल्मों घर वैक्यूम के तहत संग्रहीत और प्रयोग की जाने वाली दो सप्ताह (लंबी अवधि के भंडारण सीधे निर्धारित नहीं किया गया था के भीतर की जरूरत है, लेकिन वहाँ बहुलक फिल्मों से अधिक उम्र के दो से गठित polymersomes में नजर मतभेद हैं सप्ताह)।
यहाँ प्रस्तुत जेल की मदद से पुनर्जलीकरण प्रोटोकॉल का उपयोग करना, समान रूप से आकार polymersomes के सैकड़ों मानक उपकरण और सस्ती प्रयोगशाला अभिकर्मकों का उपयोग श्रम के कुछ ही घंटों के साथ तेजी से बनते हैं। इसके अलावा, polymersomes शारीरिक बफर समाधान की एक किस्म में और विभिन्न बहुलक रचनाओं (नहीं दिखाया गया है) से गठित किया जा सकता है। विधि के लिए मामूली परिवर्तन नकारात्मक, polymersomes के गठन को बदल नहीं है के साथ वैज्ञानिकों के प्रतिपादन जेल की मदद से पुनर्जलीकरण एक बहुमुखी और सुलभ तकनीक तकनीकी ई बदलतीxpertise।
आसानी से कोशिकाओं के आकार पैमाने पर विशाल polymersomes बनाने की क्षमता कृत्रिम कोशिका-तरह सिस्टम के निर्माण के लिए आवश्यक है। जेल की मदद से पुनर्जलीकरण के उपयोग और बहुमुखी प्रतिभा की आसानी इन polymersomes बनाने के लिए मजबूत सेल झिल्ली mimics के निर्माण के लिए biomimetic क्षेत्र में एक बड़ी उन्नति प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक का उपयोग, विभिन्न intracellular घटकों, सेल झिल्ली प्रोटीन और झिल्ली परिवहन प्रोटीन का समावेश के साथ बहुलक का functionalization, के encapsulation के लिए रणनीति बस कुछ ही नाम के लिए, polymersome आधारित कृत्रिम कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए बनाया जा सकता है।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).
Materials
| 125 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9mL capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
Referências
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