We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.
Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).
Opprettelse av syntetiske celle størrelse, gigantiske unilamellære vesikler (GUVs) er å øke interessen for in vitro oppbyggingen av ulike cellulære prosesser for å bygge et rammeverk for generering av en kunstig celle-lignende system 1,2. Mens GUVs består av lipid membraner er gode etterligner av naturlige, biologiske membraner, de er ustabile mot miljøsvingninger og har en ganske kort holdbarhet. På grunn av disse begrensninger har amfifile blokk-kopolymerer vært brukt som etterligner lipid for å danne polymer-vesikler eller polymersomes. Innenfor denne konteksten, polymersomes er en fordel i utviklingen av biomimetic cellesystemer på grunn av deres økt stabilitet 3, kjemisk allsidighet 4,5 og modifiserbare fysiske egenskaper 6 – 8.
Dagens metoder for å danne gigantiske størrelse polymersomes inkluderer electroformation 9 og malbasert rehydrering 10, begge which er tidkrevende, arbeidskrevende, krever spesialisert utstyr og produsere lave utbytter av intakte gigantiske polymersomes. En enkel gel-assistert rehydratisering metoden ble nylig utviklet for fremstilling av lipid GUVs 11. Her beskriver vi en tilpasning av den gel-assistert rehydrering teknikk for å lage store polymersomes med varierende polymerblandinger, kontrollert størrelse, og i forskjellige bufferblandinger.
I korthet, blir 1% vekt / volum av standard DNA-gel-elektroforese agarose filmer dehydratisert på et dekkglass. Polymeroppløsninger fremstilt i kloroform blir deretter spredt over dehydrert agarose film og tillatt å fordampe. Etter fullstendig fjerning av løsningsmiddel, blir polymerfilmer rehydrert i buffer av valg med moderat oppvarming (40-70 ° C) og gigant (> 4 mm) størrelse polymersomes blir dannet i løpet av 30 min. Denne metoden produserer raskt hundrevis av helt intakt, velformede polymersomes med standard laboratorieutstyr og Reagents på minimale kostnader.
Figur 1. Skjematisk viser den gel-assistert rehydrering metode. Giant polymersomes sammensatt av en diblokk-kopolymer som er dannet etter ~ 30 minutter for rehydratisering. Den hydrofile blokk er angitt i magenta og den hydrofobe blokk betegnes i grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Polymersomes blir allment utforsket som biologisk membran etterligner. Den robuste og allsidige egenskaper polymerer gjøre dem allment attraktivt for studier som krever membran funksjon, lang levetid og innstilt reaksjonsevne. Tradisjonelle metoder for dannelse av kjempestore polymersomes 9,10 (> 4 um), er arbeidskrevende og krever kostbart og spesialisert utstyr. Her presenterer vi for første gang, en hurtig, fleksibel og robust fremgangsmåte for å danne store størrelse polymersomes ved bruk av standard laboratorierimelige reagenser og utstyr.
Ved hjelp av gel-assistert rehydrering kan unilamellære polymersomes dannes raskt (<30 minutter), i en rekke av rehydrering-løsninger (inkludert cellekulturmedier) og med en rekke forskjellige polymerer (data ikke vist). Dannelse av multilamellære vesikler eller asymmetriske ble ikke observert ved anvendelse av denne teknikken. Gjennom dette arbeidet har vi brukt poly (etylenoksyd) – b- poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) nøytral diblokk copolymer. Mange forskjellige polymermaterialer (herunder belastet diblokk kopolymerer) fungerer godt sammen med denne metoden (ikke vist). Men noen kommersielt tilgjengelige triblokk kopolymerer og høyere molekylvekt diblokk kopolymerer (~> 5000 dalton) ikke danner distinkte polymersomes. For alle forsøkene i dette manuskriptet, ble en lav konsentrasjon av merket lipid dopet inn i polymerløsninger for visualisering formål. Andre metoder for visualisering, inkludert polymerer direkte funksjonalisert med et fluorescerende fargestoff kan også brukes. Polymersomes kan også avbildes med lyse felt mikroskopi, men fluorescens mikroskopi gir større oppløsning.
De fleste mindre endringer i protokollen vanligvis ikke endre resultatene. For eksempel, små forskjeller i konsentrasjonen av polymeroppløsningen spredd på objektglassene ikke forandre dannelsen av polymeren fILM dannet. Mens den kompkonsentrasjonsområdet ikke ble bestemt, vil polymersome formasjon med hell forekomme med et stort utvalg av polymerfilm konsentrasjoner (for eksempel, 1-10 mg / ml). Det er imidlertid noen protokoll endringer som negativt påvirker polymersome formasjon. Det mest bemerkelsesverdige er at runde dekkglass (i stedet for firkantet) resultat i svært dårlig dannelsen av polymersomes. Vi tilskriver dette til ekstremt jevnt lag med agarose på glasset som faktisk hindrer dannelsen av polymersomes.
Ett av de mest bemerkelsesverdige utfordringene i denne teknikk er muligheten til å gjenopprette polymersomes fra overflaten med et høyt utbytte. Det er visse tilfeller der fjerne polymersomes fra den opprinnelige overflate kan være fordelaktig. På grunn av den høye bakgrunn fluorescens fra dehydrert polymerfilm, fjerne individuelle polymersomes og følge dem til å rydde Dekk vil øke bildekvalitet og karakterisering (partisielt under FRAP analyse). For å gjøre dette, forsiktig pipettering med en pipette tips som til slutt har blitt kuttet vil desorbere polymersomes fra overflaten (om antallet vesikler gjen er betydelig lavere enn de opprinnelig dannet). Polymersomes kan deretter plasseres på modifiserte dekkflater, slik at polymersome å samvirke med den nye dekkglass. Typisk for nøytrale PEO-PBD polymersomes, Dekkglass ble behandlet med ozon i 15 minutter tillate polymersomes til å falle ned til overflaten for avbildning. Ulike overflatemodifikasjon kreves for ulike polymersome komposisjoner (f.eks negativt eller positivt ladet polymerer).
De fleste materialer som brukes i denne protokollen er med hell lagres og brukes i flere dager til uker. Den størknede agarose kan kokes og gjenbrukes til agarose begynner å ha aggregater selv etter koking, eller den størknede agarose begynner å tørke. Dekkglass med tørkede filmer agarose kan lagres og brukend ubestemt tid (f.eks måneder). Polymeren ble oppløst i kloroform kan oppbevares ved -20 ° C i flere måneder. Når polymerfilmen tørkes på agarose filmene, men filmene må lagres under husvakuum og brukes innen to uker (lengre tids lagring er ikke direkte bestemt, men det er merkbare forskjeller i polymersomes dannet fra polymerfilmer som er eldre enn to uker).
Bruke gel-assistert rehydrering protokoll som presenteres her, er hundrevis av jevnt-formet polymersomes dannet seg raskt med bare noen få timer med arbeid ved hjelp av standard utstyr og rimelig laboratoriereagenser. Videre kan polymersomes være utformet i en rekke fysiologiske bufferløsninger og fra forskjellige polymermaterialer (ikke vist). Mindre endringer i fremgangsmåten ikke negativt forandre dannelsen av polymersomes, slik at gel-assistert rehydrering en allsidig og tilgjengelig teknikk for å forskere med varierende teknisk expertise.
Muligheten til å enkelt lage gigantiske polymersomes på størrelsen omfanget av cellene er viktig for å bygge kunstige cellelignende systemer. Brukervennligheten og allsidigheten til gel-assistert rehydrering å gjøre disse polymersomes tilbyr et stort fremskritt i biomimetic feltet for etablering av robuste cellemembran etterligner. For eksempel, ved bruk av denne teknikken, strategier for innkapsling av forskjellige intracellulære komponenter, funksjonalisering av polymeren med celle-membran-proteiner og inkorporering av membrantransportproteiner, bare for å nevne noen, kan være konstruert for å bygge polymersome baserte kunstige celler.
The authors have nothing to disclose.
We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).
125 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9mL capacity, case of 144 |
Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |