تشريح وشقة-تصاعد للThreespine أبو شوكة الخيشومي الهيكل العظمي
Summary
The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.
Abstract
The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.
Introduction
كمية لا تصدق من التنوع موجود في الهيكل العظمي رئيس من بين الفقاريات، وخاصة بين الأسماك. في كثير من الحالات وهذا التنوع يسهل استراتيجيات التغذية المختلفة 1-4، ويمكن أن تنطوي على تغييرات كبيرة على كل من الزخرفة القحفي الخارجية والداخلية. يقع الهيكل العظمي الخيشومي داخليا في الحلق من الأسماك ويحيط معظم الشدق. ويتكون الهيكل العظمي الخيشومي من 5 قطاعات المتجانسة بشكل متسلسل، والأمامي أربعة منها دعم الخياشيم. معا هذه القطاعات الخمسة تعمل كحلقة وصل بين الأسماك وطعامهم 5. تباين في العديد من الصفات بما في ذلك rakers الخيشومية والأسنان البلعومية، والعظام خيشومي المساهمة في البحث عن الطعام كفاءة على أنواع مختلفة من المواد الغذائية.
خضعت أبو شوكة إشعاع التكيف بعد أشكال المحيطية الأجداد المستعمر بحيرات المياه العذبة والجداول في جميع أنحاء نصف الكرة الشمالي. التحول في النظام الغذائيوقد نتج من العوالق الحيوانية الصغيرة في المحيط الى فريسة أكبر في المياه العذبة في الاختلاف غذائي كبير في 6 عدة سمات القحفي. في حين أن العديد من الدراسات التي تركز على الاختلافات القحفي الخارجية في أبو شوكة 7-13، والتغيرات القحفي هامة تتطور بشكل متكرر في الهيكل العظمي الخيشومي الداخلي. القدرة على خلق الهجينة الخصبة بين السكان أبو شوكة سمك شائك متميزة شكليا يوفر فرصة ممتازة لخريطة الأساس الجيني للتغيرات تطورت إلى هيكل عظمي الخيشومي.
واحدة سمة الغذائية ذات أهمية إيكولوجية هي الزخرفة من rakers الخيشومية والعظام الجلدية الدورية التي تبطن الجزء الأمامي والخلفي وجوه من عظام خيشومي وتستخدم لتصفية العناصر فريسة. الأسماك التي تتغذى عادة على بنود الفرائس الصغيرة تميل إلى أن تكون أطول وأكثر كثافة rakers الخيشومية متباعدة مقارنة الأسماك التي تتغذى على أكبر فريسة 14،15. تم الإبلاغ عن الاختلاف في rakers الخيشومية على حد سواء ثithin وبين الأنواع 14-19، وجوانب الخيشومية الجراف الزخرفة تسهم في محاريب التغذية واللياقة البدنية (16). وقد وثقت عقود من البحث على نطاق واسع عدد الخيشومية الجراف والتباين طول في أبو شوكة threespine 17-21. ومع ذلك، تركز هذه الدراسات عادة على الصف الأول من rakers الخيشومية. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة نمطية في التحكم الجيني عدد الخيشومية الجراف عبر الهيكل العظمي الخيشومي 22،23 وعبر صف واحد في الجراف الخيشومية تباعد 23 وطول 24 تسليط الضوء على أهمية دراسة أكثر من صف واحد أو الجراف الخيشومية واحد لفهم الأساس الجيني التنموي للحد من الخيشومية الجراف.
هناك سمة الغذائية الثانية من أهمية بيئية والطبية على حد سواء هي الزخرفة الأسنان البلعومية. الأسنان في الأسماك يمكن أن يكون موجودا في كل من الفك عن طريق الفم وفي الهيكل العظمي الخيشومي، والمعروفة باسم الأسنان البلعومية. وتستخدم الأسنان عن طريق الفم في المقام الأول لصالقبض على ري في حين تستخدم الأسنان البلعومية لالمضغ وفريسة التلاعب 25-27. تشكل كلتا المجموعتين عبر آليات تنموية مشتركة وتعتبر تنمويا مثلي 28. يحدث نمطية للاهتمام حيث مسنن بعض الأنواع، مثل الزرد، وعدم الفم والبلعوم ظهري أسنان 29 في حين أن الأنواع الأخرى متعددة ceratobranchials مسننة، pharyngobranchials، وأحيانا قاعدة اللامي وhypobranchials 30. في أبو شوكة، وتوجد الأسنان البلعومية البطني على ceratobranchial الخامس وظهريا على الأمامي والخلفي pharyngobranchials 31. وتشير الحركيات على تغذية أبو شوكة سمك شائك ويستخدم الفك عن طريق الفم في المقام الأول لالتقاط الفريسة، وتسهيل شفط التغذية 9 ترك المضغ في الفك البلعوم. في البلطي، أقل التشكل البلعوم الفك يختلف بشكل كبير 32،33، ولقد ثبت من أن يكون متوائما والمترابطة مع مكانة الغذائية 34. متعددوقد تطورت التنوير القائل السكان أبو شوكة سمك شائك المياه العذبة زيادات حادة في البلعوم بطني الأسنان عدد 23،35،36. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة أن الأساس الجيني التنموي من هذا المكسب الأسنان تطورت يختلف إلى حد كبير في اثنين من السكان المستمدة بشكل مستقل عن أبو شوكة المياه العذبة 36. وخلافا للأسنان الثدييات والأسماك وتجديد أسنانهم باستمرار طوال حياة البالغين 37. تطورت كل من هذه العالي السكان المياه العذبة ذو أسنان وصفه سابقا بمعدل استبدال الأسنان المتسارع، وتوفير نظام الفقاريات نادرة لدراسة الأساس الجيني للتجديد 36.
هناك سمة الغذائية الثالثة التي تطورت بشكل متكرر في أبو شوكة المياه العذبة أطول فوق الخيشومية وceratobranchial العظام، وخيشومي homologs قوس قطعي من الفك العلوي والسفلي، على التوالي 38. عظام خيشومي أطول تمنح لالشدق أكبر وعلى الأرجح هي التكيف ليسمح للمواد فريسة أكبر لتكون جonsumed. وعلاوة على ذلك، في الأسماك الأخرى، وعظام فوق الخيشومية مهمة لعلاج الاكتئاب لوحات الأسنان ظهري البلعوم 25. مثل الخيشومية rakers والأسنان البلعومية، وعظام خيشومي داخلية، وبالتالي، من الصعب تصور بسهولة أو كميا.
هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتشريح وشقة جبل الهيكل العظمي-الخيشومي، مما يتيح التصور السهل وتقدير من مجموعة متنوعة من الصفات القحفي الهامة. بينما يصف هذا البروتوكول تشريح أبو شوكة سمك شائك، يعمل هذا الأسلوب نفسه في مجموعة متنوعة من الأسماك الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.
Materials
| Sodium Hydroxide (KOH) | EMD | PX1480-1 | |
| Glycerol | Sigma-Alderich | G7893-4L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin (NBF) | Azer Scientific | NBF-4-G | |
| Alizarin Red S | EMD | 116-12 | |
| Microscope Cover Glasses 22x60mm | VWR | 16004-350 | |
| 100x10mm Glass Petri Dish | Kimble Chase | 23064-10010 | To dissect samples on |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4000 | 1lb cream |
| Scintillation Vials (case of 500) | Wheaton | 66021-668 | Borosilicate Glass with Screw Cap |
| Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) | FST | 11252-20 | Dumostars are an alternative |
| Dissecting Scissors | FST | 15003-08 | Alternate sizes are available depending on size of sample |
| Dissecting Microscope | Leica | S6E with KL300 LED | Many other models work nicely, having a flat base helps |
| Microcentrifuge Tubes 1.7mL | Denville | C-2170 | |
| Cardboard slide tray | Fisher | 12-587-10 |
Referências
- Cooper, W. J., Westneat, M. W. Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches. BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).
- Albertson, R. C., Kocher, T. D. Genetic and developmental basis of cichlid trophic diversity. Heredity. 97 (3), 211-221 (2006).
- Martin, C. H., Wainwright, P. C. Trophic novelty is linked to exceptional rates of morphological diversification in two adaptive radiations of cyprinodon pupfish. Evolution. 65 (8), 2197-2212 (2011).
- Wainwright, P. C., et al. The evolution of pharyngognathy: A phylogenetic and functional appraisal of the pharyngeal jaw key innovation in labroid fishes and beyond. Syst. Biol. 61 (6), 1001-1027 (2012).
- Sibbing, F. Food capture and oral processing. Cyprinid Fishes. , 377-412 (1991).
- Bell, M., Foster, S. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
- Kimmel, C. B., et al. Evolution and development of facial bone morphology in threespine sticklebacks. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (16), 5791-5796 (2005).
- Mcgee, M. D., Wainwright, P. C. Convergent evolution as a generator of phenotypic diversity in threespine stickleback. Evolution. 67 (4), 1204-1208 (2013).
- McGee, M. D., Schluter, D., Wainwright, P. C. Functional basis of ecological divergence in sympatric stickleback. BMC Evol. Biol. 13, 277 (2013).
- McGuigan, K., Nishimura, N., Currey, M., Hurwit, D., Cresko, W. A. Quantitative genetic variation in static allometry in the threespine stickleback. Integr. Comp. Biol. 50 (6), 1067-1080 (2010).
- Caldecutt, W. J., Bell, M. A., Buckland-Nicks, J. A. Sexual dimorphism and geographic variation in dentition of threespine stickleback, Gasterosteus aculeatus. Copeia. 2001 (4), 936-944 (2001).
- Berner, D., Moser, D., Roesti, M., Buescher, H., Salzburger, W. Genetic architecture of skeletal evolution in european lake and stream stickleback. Evolution. 68 (6), 1792-1805 (2014).
- Jamniczky, H. a., Barry, T. N., Rogers, S. M. Eco-evo-devo in the study of adaptive divergence: examples from threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). Integr. Comp. Biol. 55 (1), 166-178 (2015).
- Magnuson, J., Heitz, J. Gill raker apparatus and food selectivity among mackerels, tunas, and dolphins. Fish. Bull. 69 (2), 361-370 (1971).
- Kahilainen, K. K., et al. The role of gill raker number variability in adaptive radiation of coregonid fish. Evol. Ecol. 25 (3), 573-588 (2011).
- Arnegard, M. E., et al. Genetics of ecological divergence during speciation. Nature. 511 (7509), 307-311 (2014).
- Gross, H. P., Anderson, J. M., Gross, H. P., Anderson, J. Geographic variation in the gillrakers and diet of European threespine sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Copeia. 1984 (1), 87-97 (1984).
- Hagen, D., Gilbertson, L. Geographic variation and environmental selection in Gasterosteus aculeatus L in the Pacific Northwest, America. Evolution. 26 (1), 32-51 (1972).
- McPhail, J. D. Ecology and evolution of sympatric sticklebacks (Gasterosteus): morphological and genetic evidence for a species pair in Enos Lake, British Columbia. Can. J. Zool. 62 (7), 1402-1408 (1984).
- Schluter, D., McPhail, J. D. Ecological character displacement and speciation in sticklebacks. Am. Nat. 140 (1), 85-108 (1992).
- Robinson, B. Trade offs in Habitat-specific foraging efficiency and the nascent adaptive divergence of sticklebacks in lakes. Behaviour. 137 (7), 865-888 (2000).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. Evodevo. 5 (1), (2014).
- Miller, C. T., Glazer, A. M., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait loci. Genética. 197 (1), 405-420 (2014).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5, 1463-1472 (2015).
- Wainwright, P. Functional morphology of the pharyngeal jaw apparatus. Fish Physiol. Fish Biomech. , 77-102 (2006).
- Hulsey, C. D., Fraser, G. J., Streelman, J. T. Evolution and development of complex biomechanical systems: 300 million years of fish jaws. Zebrafish. 2 (4), 243-257 (2005).
- Lauder, G. Functional design and evolution of the pharyngeal jaw apparatus in euteleostean fishes. Zool. J. Linn. Soc. 77, 1-38 (1983).
- Fraser, G. J., et al. An ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaws. PLoS Biol. 7 (2), e1000031 (2009).
- Stock, D. Zebrafish dentition in comparative context. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 523-549 (2007).
- Liem, K., Greenwood, P. A functional approach to the phylogeny of the pharyngognath teleosts. Am. Zool. 21 (1), 83-101 (1981).
- Anker, G. C. Morphology and kinetics of the head of the stickleback, Gasterosteus aculeatus. Trans. Zool. Soc. London. 32 (5), 311-416 (1974).
- Meyer, A. Morphometrics and allometry in the trophically polymorphic cichlid fish, Cichlusomu citrinelfum: Alternative adaptations and ontogenetic changes in shape. J. Zool., Lond. 221, 237-260 (1990).
- Huysseune, A. Phenotypic plasticity in the lower pharyngeal jaw dentition of Astatoreochromis alluaudi (Teleostei: Cichlidae). Arch. Oral Biol. 40 (11), 1005-1014 (1995).
- Muschick, M., Indermaur, A., Salzburger, W. Convergent Evolution within an adaptive radiation of cichlid fishes. Curr. Biol. 22 (24), 2362-2368 (2012).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. (142), 2442-2451 (2015).
- Tucker, A. S., Fraser, G. J. Evolution and developmental diversity of tooth regeneration. Semin. Cell Dev. Biol. 25-26, 71-80 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. B. 281, (2014).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- Bell, M. A. Evolutionary phenetics and genetics. Evol. Genet. Fishes. , 431-528 (1984).
- Taylor, W. R., Van Dyke, G. C. Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study. Cybium. 9 (2), 107-119 (1985).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Miller, C. T., et al. cis-Regulatory changes in Kit ligand expression and parallel evolution of pigmentation in sticklebacks and humans. Cell. 131 (6), 1179-1189 (2007).
- Aigler, S. R., Jandzik, D., Hatta, K., Uesugi, K., Stock, D. W. Selection and constraint underlie irreversibility of tooth loss in cypriniform fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (21), 7707-7712 (2014).
- Pasco-Viel, E., et al. Evolutionary trends of the pharyngeal dentition in Cypriniformes (Actinopterygii Ostariophysi). PLoS One. 5 (6), e11293 (2010).
