Dissection et Flat-montage de l'épinoche à trois épines branchiale Squelette
Summary
The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.
Abstract
The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.
Introduction
Une quantité incroyable de diversité existe dans le squelette de la tête chez les vertébrés, en particulier chez les poissons. Dans de nombreux cas , cette diversité facilite les stratégies d'alimentation différentes : 1 – 4, et peut impliquer des changements majeurs à la fois un motif craniofaciale externe et interne. Le squelette branchial est situé à l'intérieur de la gorge d'un poisson et qui entoure la majeure partie de la cavité buccale. Le squelette branchial est composé de 5 segments en série homologues, les quatre antérieure qui soutiennent les branchies. Ensemble , ces cinq segments fonctionnent comme une interface entre les poissons et leur nourriture 5. Variation dans une multitude de traits, y compris branchiospines, dents pharyngiennes, et les os branchiaux contribuent à la recherche de nourriture efficace sur les différents types d'aliments.
Épinoches ont subi une radiation adaptative après des formes océaniques ancestrales colonisées lacs d'eau douce et les criques tout l'hémisphère nord. Le changement dans le régime alimentairedu petit zooplancton dans l'océan à des proies plus grosses en eau douce a donné lieu à une variation trophique dramatique dans plusieurs traits craniofaciales 6. Alors que de nombreuses études ont porté sur les différences craniofaciales externes dans épinoches 7 – 13, des changements importants craniofaciales évoluent de façon répétée dans le squelette branchial interne. La possibilité de créer des hybrides fertiles entre les populations d'épinoches morphologiquement distinctes offre une excellente occasion de cartographier la base génétique des changements ont évolué vers le squelette branchial.
Un trait trophique d'importance écologique est la structuration des branchicténies, des os dermiques périodiques qui tapissent les faces antérieure et postérieure des os branchies et sont utilisés pour filtrer les proies. Les poissons qui se nourrissent généralement sur de petits objets de proies ont tendance à avoir plus et plus densément maillant espacées branchicténies par rapport aux poissons qui se nourrissent de proies plus grosses 14,15. Variation branchicténies a été rapporté à la fois wSEIN et entre les espèces 14-19, et les aspects de la branchicténies patterning contribuent à des niches trophiques et remise en forme 16. Des décennies de recherche ont largement documenté nombre maillant racloir et la variation de longueur dans épinoches à trois épines 17 – 21; Toutefois, ces études se concentrent généralement sur la première rangée de branchiospines. Des travaux récents ont montré la modularité dans le contrôle génétique du nombre maillant racloir à travers le squelette branchial 22,23 et à travers une seule ligne dans branchicténies espacement 23 et la longueur 24 mettant en évidence l'importance d'étudier plus de ramer un ou une seule raker maillant pour comprendre le base génétique du développement de la réduction des branchies racloir.
Un second trait trophique de signification à la fois écologique et biomédicale est le motif de dents pharyngées. Dents chez les poissons peuvent être situés à la fois dans la mâchoire, et par voie orale dans le squelette branchial, connu sous le nom de dents pharyngées. dents orales sont utilisées principalement pour prey capturer tout les dents pharyngées sont utilisés pour la mastication et la proie manipulation 25 – 27. Les deux ensembles forment par l' intermédiaire des mécanismes de développement partagés et sont considérés comme de développement homologue 28. Modularité intéressante se produit où certaines espèces, comme le poisson zèbre, le manque de dents pharyngée orale et dorsale 29 tandis que d' autres espèces ont plusieurs cératobranchiaux dentées, pharyngobranchials, et parfois dentées basihyal et hypobranchiaux 30. Dans épinoches dents pharyngiennes se trouvent sur le côté ventral et cinquième ceratobranchial dorsalement sur la partie antérieure et postérieure pharyngobranchials 31. Cinématique sur l' épinoche alimentation montrent la mâchoire orale est principalement utilisé pour la capture des proies et de faciliter l' aspiration d' alimentation 9 en laissant la mastication à la mâchoire du pharynx. Dans cichlidés, inférieure morphologie pharyngée de la mâchoire varie considérablement 32,33 et a été montré pour être adaptatif et en corrélation avec niche trophique 34. Multiles populations d' eau douce d'épinoches ples ont évolué une augmentation spectaculaire de pharyngée ventral nombre de dents 23,35,36. Des travaux récents ont montré que la base génétique du développement de ce gain de dent évolué est en grande partie distincte dans deux populations dérivées indépendamment des épinoches d'eau douce 36. Contrairement à dents de mammifères, les poissons se régénèrent leurs dents en permanence tout au long de la vie adulte 37. Ces deux populations précédemment décrites en eau douce dentées élevées ont évolué un taux de remplacement de la dent accélérée, fournissant un système de vertébrés rares pour étudier la base génétique de la régénération 36.
Un troisième trait trophique qui a évolué à plusieurs reprises dans les épinoches d'eau douce est plus long os épibranchiales et ceratobranchial, les branchies homologues arc segmentaire de la mâchoire supérieure et inférieure, respectivement 38. Plus longs os branchiaux confèrent une plus grande cavité buccale et probablement sont adaptatifs pour permettre à de plus grandes proies soient consumed. En outre, dans d' autres poissons, les os épibranchiales sont importants pour la dépression des dorsale pharynx dents plaques 25. Comme branchicténies et les dents pharyngées, les os branchiaux sont internes et donc, difficile de visualiser facilement ou quantifier.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour disséquer et plat monter le squelette branchial, permettant une visualisation facile et la quantification d'une variété de traits craniofaciales importants. Bien que ce protocole décrit une dissection de l'épinoche, cette même méthode fonctionne sur une variété d'autres poissons.
Protocol
Representative Results
Discussion
The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.
Materials
| Sodium Hydroxide (KOH) | EMD | PX1480-1 | |
| Glycerol | Sigma-Alderich | G7893-4L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin (NBF) | Azer Scientific | NBF-4-G | |
| Alizarin Red S | EMD | 116-12 | |
| Microscope Cover Glasses 22x60mm | VWR | 16004-350 | |
| 100x10mm Glass Petri Dish | Kimble Chase | 23064-10010 | To dissect samples on |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4000 | 1lb cream |
| Scintillation Vials (case of 500) | Wheaton | 66021-668 | Borosilicate Glass with Screw Cap |
| Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) | FST | 11252-20 | Dumostars are an alternative |
| Dissecting Scissors | FST | 15003-08 | Alternate sizes are available depending on size of sample |
| Dissecting Microscope | Leica | S6E with KL300 LED | Many other models work nicely, having a flat base helps |
| Microcentrifuge Tubes 1.7mL | Denville | C-2170 | |
| Cardboard slide tray | Fisher | 12-587-10 |
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