Dissezione e Flat-montaggio del Threespine Stickleback branchiale scheletro

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

Una quantità incredibile di diversità esiste nello scheletro testa tra i vertebrati, soprattutto tra i pesci. In molti casi questa diversità facilita differenti strategie di alimentazione ^{1 – 4,} e può comportare importanti modifiche sia modello craniofacciale esterna e interna. Lo scheletro branchiale è situato internamente nella gola di un pesce e circonda la maggior parte della cavità buccale. Lo scheletro branchiale comprende 5 segmenti omologhi serialmente, anteriore quattro delle quali supportano branchie. Insieme, queste cinque segmenti funzionano da interfaccia tra i pesci e il loro cibo ^5. Variazione in una moltitudine di tratti, tra cui branchiospine, denti faringei, e le ossa branchiali contribuire a foraggiare efficace su diversi tipi di cibo.

Spinarelli sono stati sottoposti a una radiazione adattativa dopo forme ancestrali oceaniche colonizzati laghi d'acqua dolce e torrenti in tutto l'emisfero settentrionale. Il cambiamento nella dietadal piccolo zooplancton nell'oceano di grande preda in acqua dolce ha provocato drammatica variazione trofico in diversi tratti cranio-facciali ^6. Mentre molti studi si sono concentrati sulle differenze cranio esterni in spinarelli ^{7 – 13,} importanti cambiamenti cranio-facciali evolvono più volte nello scheletro branchiale interna. La possibilità di creare ibridi fecondi tra le popolazioni spinarello morfologicamente distinte offre un'eccellente opportunità per mappare la base genetica delle modifiche si sono evoluti per lo scheletro branchiale.

Una caratteristica trofico di importanza ecologica è il patterning di branchiospine, ossa dermiche periodici che costeggiano le facce anteriore e posteriore delle ossa branchiali e sono utilizzati per filtrare prede. I pesci che in genere si nutrono di piccoli oggetti preda tendono ad avere più a lungo e più densamente spaziati Gill rakers rispetto ai pesci che si nutrono sulla preda più grande ^14,15. Variazione branchiospine stato segnalato sia wntro e tra le specie ^14-19, e gli aspetti di Gill raker patterning contribuiscono a nicchie trofiche e fitness ^16. Decenni di ricerche hanno ampiamente documentato numero Gill raker e variazione di lunghezza in spinarelli threespine ^{17 – 21;} Tuttavia, questi studi in genere si concentrano sulla prima fila di branchiospine. Studi recenti hanno dimostrato modularità nel controllo genetico del numero branchiali raker attraverso lo scheletro branchiale ^22,23 e attraverso una singola riga in branchiali raker spaziatura ²³ e lunghezza ²⁴ mettendo in evidenza l'importanza di studiare più di remare uno o un singolo rastrello branchia per capire il sviluppo basi genetiche della riduzione Gill raker.

Un secondo tratto trofico sia di importanza ecologica e biomedica è il patterning di denti faringei. Denti in pesci possono essere posizionati sia nella mascella orale e nello scheletro branchiale, noto come i denti faringei. denti orali sono utilizzati principalmente per prey catturare mentre denti faringei sono utilizzati per la masticazione e la preda manipolazione ^{25 – 27.} Entrambi i gruppi si formano tramite meccanismi di sviluppo condivisi e sono considerati evolutivamente omologa ^28. Modularità Interessante si verifica per cui alcune specie, come zebrafish, mancanza orale e della faringe dorsale denti ^29, mentre le altre specie hanno più ceratobranchials dentate, pharyngobranchials, e talvolta dentate basihyal e hypobranchials ^30. In spinarelli, denti faringei si trovano ventrale al quinto ceratobranchial e dorsalmente sul anteriore e posteriore pharyngobranchials ^31. Cinematica di alimentazione stickleback mostrano la mascella orale viene utilizzato principalmente per la cattura la preda e facilitare l'alimentazione ^di aspirazione ⁹ lasciando la masticazione alla mascella faringea. In ciclidi, inferiore faringeo mascella morfologia varia notevolmente ^32,33 e ha dimostrato di essere adattivo e correlato con nicchia trofica ^34. MultiPLE popolazioni stickleback d'acqua dolce si sono evoluti gli aumenti drammatici nella ventrale faringea numero di denti ^23,35,36. Studi recenti hanno dimostrato che la base genetica evolutiva di questo guadagno dente evoluto è in gran parte distinta in due popolazioni derivate indipendentemente spinarelli d'acqua dolce ^36. A differenza di denti di mammiferi, pesci rigenerare i denti continuamente per tutta la vita adulta ^37. Entrambe queste popolazioni di acqua dolce dentate alti precedentemente descritti si sono evoluti un tasso di sostituzione dei denti accelerato, fornendo un sistema di vertebrati rara per studiare le basi genetiche della rigenerazione ^36.

Una terza caratteristica trofica che si è evoluta più volte in spinarelli d'acqua dolce è più ossa epibranchial e ceratobranchial, le branchiali omologhi arco ribassato della mascella superiore e inferiore, rispettivamente ^38. Più lunghe ossa branchiali conferiscono una grande cavità orale e probabilmente sono adattativi per consentire prede più grandi per essere Consumed. Inoltre, in altri pesci, ossa epibranchial sono importanti per la depressione delle lastre dei denti dorsale faringei ^25. Come rastrelli branchiali e denti faringei, le ossa branchiali sono interni e, quindi, difficile da visualizzare o quantificare facilmente.

Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per sezionare e TV a montare lo scheletro branchiale, consentendo una facile visualizzazione e la quantificazione di una varietà di importanti caratteristiche cranio-facciali. Mentre questo protocollo descrive una dissezione stickleback, questo stesso metodo funziona su una varietà di altri pesci.

Protocol

Tutti i lavori di pesce è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e l'uso della University of California-Berkeley (numero di protocollo R330). L'eutanasia è stata effettuata utilizzando immersione in 0,025% tricaine-S tamponata con 0,1% di bicarbonato di sodio 39. Tutte le fasi sono eseguite a temperatura ambiente. 1. Preparazione Nota: Eseguire i passi 1.1-1.5 in tubi conici o fiale di scintillazione in grado di sigillare ermeticamente ed essere fissate in orizzo…

Representative Results

Questo protocollo si traduce in uno scheletro branchiale montato sezionato e piatta (Figura 4), ​​dove una serie di importanti caratteristiche trofiche può essere quantificato. Dal punto di vista dorsale, tutte le righe di branchiospine, tutte le lastre della faringe denti, e quasi tutte le ossa branchiali possono essere facilmente visualizzati e quantificati 22 – 24,35,36,38,42. Alizarina Rossa S reagisce anche su rodamina o f…

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10