La disección y-montaje plana del esqueleto branquial de tres espinas Stickleback
Summary
The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.
Abstract
The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.
Introduction
Una cantidad increíble de la diversidad existente en el esqueleto de la cabeza entre los vertebrados, en especial entre los peces. En muchos casos esta diversidad facilita diferentes estrategias de alimentación 1-4, y puede implicar cambios importantes en tanto patrón craneofacial externa e interna. El esqueleto branquial está situado internamente en la garganta de un pez y rodea la mayor parte de la cavidad bucal. El esqueleto branquial se compone de 5 segmentos serie homóloga, la parte anterior de cuatro de los cuales apoyan las branquias. En conjunto, estos cinco segmentos funcionan como una interfaz entre el pescado y sus alimentos 5. La variación en una multitud de rasgos incluyendo branquiespinas, dientes faríngeos, y los huesos branquiales contribuyen a forrajeo eficiente en diferentes tipos de alimentos.
Espinosos han sido sometidos a una radiación adaptativa después de formas ancestrales oceánicas colonizados lagos de agua dulce y arroyos en todo el hemisferio norte. El cambio en la dietadel zooplancton pequeño en el océano para una presa más grande en el agua dulce se ha traducido en la variación trófica dramático en varios rasgos craneofaciales 6. Mientras que muchos estudios se han centrado en las diferencias craneofaciales externos en los espinosos 7 – 13, los cambios craneofaciales importantes evolucionan en repetidas ocasiones en el esqueleto branquial interno. La capacidad de crear híbridos fértiles entre poblaciones de espinosos morfológicamente distintos proporciona una excelente oportunidad para mapear la base genética de los cambios evolucionado hasta el esqueleto branquial.
Un rasgo trófica de importancia ecológica es el patrón de hendiduras branquiales, los huesos dérmicos periódicas que recubren las caras anterior y posterior de los huesos branquiales y se utilizan para filtrar los elementos de presa. Los peces que normalmente se alimentan de pequeñas presas tienden a tener más largo y más densamente espaciados Gill RäKERS en comparación con los peces que se alimentan de presas más grandes 14,15. La variación en branquiespinas ha informado tanto wentro de las especies y entre 14-19, y los aspectos de enmalle de profundidad de corte de patrones contribuyen a nichos tróficos y gimnasio 16. Décadas de investigación han documentado ampliamente el número de enmalle de profundidad de corte y la variación de la longitud de los peces espinosos de tres espinas 17 – 21; Sin embargo, estos estudios suelen centrarse en la primera fila de hendiduras branquiales. Trabajos recientes han demostrado la modularidad en el control genético del número de enmalle de profundidad de corte a través del esqueleto branquial 22,23 ya través de una sola fila en la profundidad de corte de enmalle espaciamiento 23 y 24 de longitud que destaca la importancia de estudiar más de la fila uno o un solo diente de ataque de enmalle para entender la base genética del desarrollo de la reducción de enmalle de profundidad de corte.
Un segundo rasgo trófica de tanto significado ecológico y biomédica es el patrón de los dientes faríngeos. Los dientes en los peces pueden estar situados tanto en la mandíbula oral y en el esqueleto branquial, conocido como dientes faríngeos. dientes orales se utilizan principalmente para pRey capturar mientras que los dientes faríngeos se utilizan para la masticación y la presa de manipulación 25 – 27. Ambos conjuntos se forman a través de los mecanismos de desarrollo compartidos y se consideran homólogas de desarrollo 28. Modularidad interesante se produce mediante el cual algunas especies, como el pez cebra, la falta de dientes de la faringe oral y dorsal 29, mientras que otras especies tienen múltiples ceratobranchials dentadas, pharyngobranchials y, a veces dentadas basihyal y hypobranchials 30. En los espinosos, dientes faríngeos se encuentran ventralmente en la quinta ceratobranquial y dorsalmente en la parte anterior y posterior pharyngobranchials 31. Cinemática sobre la alimentación del pez espinoso muestran la mandíbula oral se utiliza principalmente para la captura de presas y facilitar la alimentación de aspiración 9 dejando la masticación de la mandíbula faríngea. En cíclidos, menor morfología de la mandíbula faríngea varía dramáticamente 32,33 y se ha demostrado que ser adaptable y se correlacionó con nicho trófico 34. Multipoblaciones de espinosos de agua dulce ples han evolucionado aumentos espectaculares en la faringe ventral número de dientes 23,35,36. Trabajos recientes han demostrado que la base genética del desarrollo de esta ganancia diente evolucionado en gran medida es distinta en dos poblaciones derivadas independientemente de espinosos de agua dulce 36. A diferencia de los dientes de mamíferos, peces regeneran sus dientes de forma continua durante la vida adulta 37. Ambas poblaciones de agua dulce dentadas altas anteriormente descritos han evolucionado una tasa de reemplazo de dientes acelerado, proporcionando un sistema de vertebrados rara para estudiar la base genética de regeneración 36.
Un tercer rasgo trófico que se ha desarrollado en varias ocasiones en los espinosos de agua dulce es más largo y huesos epibranchial ceratobranquiales, los homólogos de arco rebajado branquiales de la mandíbula superior e inferior, respectivamente 38. Más largos huesos branquiales confieren una cavidad bucal grande y probablemente son adaptativos para permitir que las presas más grandes para ser Consumed. Por otra parte, en otro pescado, huesos epibranchial son importantes para la depresión de las placas de dientes faríngeos dorsal 25. Al igual que branquiespinas y dientes faríngeos, los huesos branquiales son internos y, por tanto, difíciles de visualizar con facilidad o cuantificar.
Aquí se presenta un protocolo detallado para diseccionar y de montaje en el esqueleto branquial plana, lo que permite una fácil visualización y cuantificación de una variedad de importantes rasgos craneofaciales. Si bien este protocolo describe una disección stickleback, este mismo método funciona en una variedad de otros peces.
Protocol
Representative Results
Discussion
The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.
Materials
| Sodium Hydroxide (KOH) | EMD | PX1480-1 | |
| Glycerol | Sigma-Alderich | G7893-4L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin (NBF) | Azer Scientific | NBF-4-G | |
| Alizarin Red S | EMD | 116-12 | |
| Microscope Cover Glasses 22x60mm | VWR | 16004-350 | |
| 100x10mm Glass Petri Dish | Kimble Chase | 23064-10010 | To dissect samples on |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4000 | 1lb cream |
| Scintillation Vials (case of 500) | Wheaton | 66021-668 | Borosilicate Glass with Screw Cap |
| Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) | FST | 11252-20 | Dumostars are an alternative |
| Dissecting Scissors | FST | 15003-08 | Alternate sizes are available depending on size of sample |
| Dissecting Microscope | Leica | S6E with KL300 LED | Many other models work nicely, having a flat base helps |
| Microcentrifuge Tubes 1.7mL | Denville | C-2170 | |
| Cardboard slide tray | Fisher | 12-587-10 |
Referências
- Cooper, W. J., Westneat, M. W. Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches. BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).
- Albertson, R. C., Kocher, T. D. Genetic and developmental basis of cichlid trophic diversity. Heredity. 97 (3), 211-221 (2006).
- Martin, C. H., Wainwright, P. C. Trophic novelty is linked to exceptional rates of morphological diversification in two adaptive radiations of cyprinodon pupfish. Evolution. 65 (8), 2197-2212 (2011).
- Wainwright, P. C., et al. The evolution of pharyngognathy: A phylogenetic and functional appraisal of the pharyngeal jaw key innovation in labroid fishes and beyond. Syst. Biol. 61 (6), 1001-1027 (2012).
- Sibbing, F. Food capture and oral processing. Cyprinid Fishes. , 377-412 (1991).
- Bell, M., Foster, S. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
- Kimmel, C. B., et al. Evolution and development of facial bone morphology in threespine sticklebacks. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (16), 5791-5796 (2005).
- Mcgee, M. D., Wainwright, P. C. Convergent evolution as a generator of phenotypic diversity in threespine stickleback. Evolution. 67 (4), 1204-1208 (2013).
- McGee, M. D., Schluter, D., Wainwright, P. C. Functional basis of ecological divergence in sympatric stickleback. BMC Evol. Biol. 13, 277 (2013).
- McGuigan, K., Nishimura, N., Currey, M., Hurwit, D., Cresko, W. A. Quantitative genetic variation in static allometry in the threespine stickleback. Integr. Comp. Biol. 50 (6), 1067-1080 (2010).
- Caldecutt, W. J., Bell, M. A., Buckland-Nicks, J. A. Sexual dimorphism and geographic variation in dentition of threespine stickleback, Gasterosteus aculeatus. Copeia. 2001 (4), 936-944 (2001).
- Berner, D., Moser, D., Roesti, M., Buescher, H., Salzburger, W. Genetic architecture of skeletal evolution in european lake and stream stickleback. Evolution. 68 (6), 1792-1805 (2014).
- Jamniczky, H. a., Barry, T. N., Rogers, S. M. Eco-evo-devo in the study of adaptive divergence: examples from threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). Integr. Comp. Biol. 55 (1), 166-178 (2015).
- Magnuson, J., Heitz, J. Gill raker apparatus and food selectivity among mackerels, tunas, and dolphins. Fish. Bull. 69 (2), 361-370 (1971).
- Kahilainen, K. K., et al. The role of gill raker number variability in adaptive radiation of coregonid fish. Evol. Ecol. 25 (3), 573-588 (2011).
- Arnegard, M. E., et al. Genetics of ecological divergence during speciation. Nature. 511 (7509), 307-311 (2014).
- Gross, H. P., Anderson, J. M., Gross, H. P., Anderson, J. Geographic variation in the gillrakers and diet of European threespine sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Copeia. 1984 (1), 87-97 (1984).
- Hagen, D., Gilbertson, L. Geographic variation and environmental selection in Gasterosteus aculeatus L in the Pacific Northwest, America. Evolution. 26 (1), 32-51 (1972).
- McPhail, J. D. Ecology and evolution of sympatric sticklebacks (Gasterosteus): morphological and genetic evidence for a species pair in Enos Lake, British Columbia. Can. J. Zool. 62 (7), 1402-1408 (1984).
- Schluter, D., McPhail, J. D. Ecological character displacement and speciation in sticklebacks. Am. Nat. 140 (1), 85-108 (1992).
- Robinson, B. Trade offs in Habitat-specific foraging efficiency and the nascent adaptive divergence of sticklebacks in lakes. Behaviour. 137 (7), 865-888 (2000).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. Evodevo. 5 (1), (2014).
- Miller, C. T., Glazer, A. M., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait loci. Genética. 197 (1), 405-420 (2014).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5, 1463-1472 (2015).
- Wainwright, P. Functional morphology of the pharyngeal jaw apparatus. Fish Physiol. Fish Biomech. , 77-102 (2006).
- Hulsey, C. D., Fraser, G. J., Streelman, J. T. Evolution and development of complex biomechanical systems: 300 million years of fish jaws. Zebrafish. 2 (4), 243-257 (2005).
- Lauder, G. Functional design and evolution of the pharyngeal jaw apparatus in euteleostean fishes. Zool. J. Linn. Soc. 77, 1-38 (1983).
- Fraser, G. J., et al. An ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaws. PLoS Biol. 7 (2), e1000031 (2009).
- Stock, D. Zebrafish dentition in comparative context. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 523-549 (2007).
- Liem, K., Greenwood, P. A functional approach to the phylogeny of the pharyngognath teleosts. Am. Zool. 21 (1), 83-101 (1981).
- Anker, G. C. Morphology and kinetics of the head of the stickleback, Gasterosteus aculeatus. Trans. Zool. Soc. London. 32 (5), 311-416 (1974).
- Meyer, A. Morphometrics and allometry in the trophically polymorphic cichlid fish, Cichlusomu citrinelfum: Alternative adaptations and ontogenetic changes in shape. J. Zool., Lond. 221, 237-260 (1990).
- Huysseune, A. Phenotypic plasticity in the lower pharyngeal jaw dentition of Astatoreochromis alluaudi (Teleostei: Cichlidae). Arch. Oral Biol. 40 (11), 1005-1014 (1995).
- Muschick, M., Indermaur, A., Salzburger, W. Convergent Evolution within an adaptive radiation of cichlid fishes. Curr. Biol. 22 (24), 2362-2368 (2012).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. (142), 2442-2451 (2015).
- Tucker, A. S., Fraser, G. J. Evolution and developmental diversity of tooth regeneration. Semin. Cell Dev. Biol. 25-26, 71-80 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. B. 281, (2014).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- Bell, M. A. Evolutionary phenetics and genetics. Evol. Genet. Fishes. , 431-528 (1984).
- Taylor, W. R., Van Dyke, G. C. Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study. Cybium. 9 (2), 107-119 (1985).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Miller, C. T., et al. cis-Regulatory changes in Kit ligand expression and parallel evolution of pigmentation in sticklebacks and humans. Cell. 131 (6), 1179-1189 (2007).
- Aigler, S. R., Jandzik, D., Hatta, K., Uesugi, K., Stock, D. W. Selection and constraint underlie irreversibility of tooth loss in cypriniform fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (21), 7707-7712 (2014).
- Pasco-Viel, E., et al. Evolutionary trends of the pharyngeal dentition in Cypriniformes (Actinopterygii Ostariophysi). PLoS One. 5 (6), e11293 (2010).
