Dissection och Platt-montering av storspigg branchial skelett

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

En otrolig mängd mångfald finns i huvudet skelett bland ryggradsdjur, särskilt bland fiskar. I många fall denna mångfald underlättar olika strategier utfodrings ^1-4, och kan innebära stora förändringar för både externa och interna kraniofaciala mönstring. Den branchial skelettet ligger internt i halsen av en fisk och omger större delen av munhålan. Den branchial skelett består av 5 serie homologa segment, den främre fyra som stöder gälarna. Tillsammans utgör dessa fem segment fungerar som ett gränssnitt mellan fisk och deras mat ^5. Variation i en mängd egenskaper, inklusive Gälräfständer, svalg tänder, och branchial ben bidrar till en effektiv föda på olika typer av mat.

Spigg har genomgått en adaptiv strålning efter förfäders havs former koloniserade sötvattensjöar och bäckar i hela norra halvklotet. Förskjutningen i dietenfrån små djurplankton i havet till större byten i sötvatten har resulterat i dramatisk trofisk variation i flera kraniofaciala drag ^sex. Även om många studier har fokuserat på externa kraniofaciala skillnader i spigg ^{7 – 13} viktiga kraniofaciala förändringar utvecklas upprepade gånger i den interna brankiala skelett. Möjligheten att skapa bördiga hybrider mellan morfologiskt distinkta Pigg populationer ger ett utmärkt tillfälle att kartlägga den genetiska grunden för utvecklade förändringar i branchial skelettet.

En trofisk drag av ekologiska betydelse är mönstring av Gälräfständer, periodiska dermal ben som kantar de främre och bakre ytorna hos branchial ben och används för att filtrera byten. Fisk som vanligtvis äter små byten tenderar att ha längre och tätare fördelade Gälräfständer jämfört med fisk som livnär sig på större byten ^14,15. Variation i Gälräfständer har rapporterats både wnom och mellan arter ^14-19, och aspekter av gill raker mönstring bidra till närings nischer och fitness ^16. Årtionden av forskning har väldokumenterade gill raker antal och längd variation i threespine spigg ^{17 – 21;} emellertid dessa studier fokuserar typiskt på den första raden i Gälräfständer. Senaste arbete har visat modularitet i den genetiska kontrollen av gill ställningsnummer över branchial skelett ^22,23 och över en enda rad i gill raker avstånd ²³ och längd ²⁴ betonar vikten av att studera mer än raden en eller ett enda gill raker att förstå utvecklings genetiska grunden för gill ställnings minskning.

En andra trofiska drag av både ekologiska och biomedicinsk betydelse är mönstring av svalget tänder. Tänder i fiskar kan placeras i både den orala käken och i brankiala skelett, känd som faryngeala tänder. Orala tänder används främst för prey fånga medan svalg tänder används för tugg och byte manipulation ^25-27. Båda uppsättningarna bildar via gemensamma utvecklingsmekanismer och anses utvecklings homolog ^28. Intressant modularitet sker där vissa arter, såsom zebrafisk, brist oral och rygg svalget tänder ^29, medan andra arter har flera tandade ceratobranchials, pharyngobranchials, och ibland tandade basihyal och hypobranchials ^30. I sticklebacks är svalg tänder hittas ventralt på femte ceratobranchial och dorsalt på den främre och bakre pharyngobranchials ^31. Kinematik på Pigg utfodring visar den orala käken används främst för byte infångning och underlätta sug utfodring ⁹ lämnar tugg till svalg käken. I ciklider varierar lägre svalget käken morfologi dramatiskt ^32,33 och har visat sig vara adaptiv och korreleras med trofiska nisch ^34. MångPLE sötvatten Pigg populationer har utvecklats dramatiska ökningar i ventrala svalg tand nummer ^23,35,36. Senaste arbete har visat att utvecklings genetiska grunden för detta utvecklats tand vinst är i hög grad skiljer sig i två oberoende härledda populationer av sötvatten spigg ^36. Till skillnad från däggdjurs tänder, fisk regenerera sina tänder kontinuerligt under vuxenlivet ^37. Båda dessa tidigare beskrivna höga tandade sötvattenspopulationer har utvecklats en accelererad tandersättningsgrad, vilket ger en sällsynt ryggradsdjur för att studera den genetiska grunden för regenerering ^36.

En tredje trofisk drag som har utvecklats flera gånger i sötvatten sticklebacks är längre epibranchial och ceratobranchial ben, de brankiala bågen segmenthomologer av den övre och undre käken, respektive ^38. Längre branchial ben ger en större munhålan och sannolikt är adaptiv för att tillåta större byten att vara consumed. Vidare i andra fiskar, epibranchial ben är viktiga för depression av rygg faryngeala tandplattorna ^25. Liksom Gälräfständer och svalg tänder, de branchial ben är interna och därmed svårt att enkelt visualisera eller kvantifiera.

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att dissekera och platt-montera branchial skelettet, vilket gör det enkelt visualisering och kvantifiering av en rad viktiga kraniofaciala drag. Även om detta protokoll beskriver en spigg dissektion, fungerar denna samma metod på en variation av andra fiskar.

Protocol

All fisk arbete godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of California-Berkeley (protokollnummer R330). Eutanasi utfördes med användning av nedsänkning i 0,025% tricaine-S buffrade med 0,1% natriumbikarbonat 39. Alla steg utförs vid rumstemperatur. 1. Beredning Obs: Utför steg 1,1-1,5 i koniska rör eller scintillationsfläskor som kan försegla tätt och läggas horisontellt. Fisk behöver inte ständigt skakas, men försök att blanda lösningen s?…

Representative Results

Detta protokoll resulterar i en dissekeras och platt monterad branchial skelett (Figur 4) där en mängd viktiga trofiska egenskaper kan kvantifieras. Från en rygg vy kan alla rader av Gälräfständer alla svalget tandplattor, och nästan alla branchial ben enkelt visualiseras och kvantifieras 22 – 24,35,36,38,42. Alizarin Rött S fluorescerar också på ett rhodamin eller liknande rött filter tillåter dubbel märkning med andra…

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10