The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.
The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.
En otrolig mängd mångfald finns i huvudet skelett bland ryggradsdjur, särskilt bland fiskar. I många fall denna mångfald underlättar olika strategier utfodrings 1-4, och kan innebära stora förändringar för både externa och interna kraniofaciala mönstring. Den branchial skelettet ligger internt i halsen av en fisk och omger större delen av munhålan. Den branchial skelett består av 5 serie homologa segment, den främre fyra som stöder gälarna. Tillsammans utgör dessa fem segment fungerar som ett gränssnitt mellan fisk och deras mat 5. Variation i en mängd egenskaper, inklusive Gälräfständer, svalg tänder, och branchial ben bidrar till en effektiv föda på olika typer av mat.
Spigg har genomgått en adaptiv strålning efter förfäders havs former koloniserade sötvattensjöar och bäckar i hela norra halvklotet. Förskjutningen i dietenfrån små djurplankton i havet till större byten i sötvatten har resulterat i dramatisk trofisk variation i flera kraniofaciala drag sex. Även om många studier har fokuserat på externa kraniofaciala skillnader i spigg 7 – 13 viktiga kraniofaciala förändringar utvecklas upprepade gånger i den interna brankiala skelett. Möjligheten att skapa bördiga hybrider mellan morfologiskt distinkta Pigg populationer ger ett utmärkt tillfälle att kartlägga den genetiska grunden för utvecklade förändringar i branchial skelettet.
En trofisk drag av ekologiska betydelse är mönstring av Gälräfständer, periodiska dermal ben som kantar de främre och bakre ytorna hos branchial ben och används för att filtrera byten. Fisk som vanligtvis äter små byten tenderar att ha längre och tätare fördelade Gälräfständer jämfört med fisk som livnär sig på större byten 14,15. Variation i Gälräfständer har rapporterats både wnom och mellan arter 14-19, och aspekter av gill raker mönstring bidra till närings nischer och fitness 16. Årtionden av forskning har väldokumenterade gill raker antal och längd variation i threespine spigg 17 – 21; emellertid dessa studier fokuserar typiskt på den första raden i Gälräfständer. Senaste arbete har visat modularitet i den genetiska kontrollen av gill ställningsnummer över branchial skelett 22,23 och över en enda rad i gill raker avstånd 23 och längd 24 betonar vikten av att studera mer än raden en eller ett enda gill raker att förstå utvecklings genetiska grunden för gill ställnings minskning.
En andra trofiska drag av både ekologiska och biomedicinsk betydelse är mönstring av svalget tänder. Tänder i fiskar kan placeras i både den orala käken och i brankiala skelett, känd som faryngeala tänder. Orala tänder används främst för prey fånga medan svalg tänder används för tugg och byte manipulation 25-27. Båda uppsättningarna bildar via gemensamma utvecklingsmekanismer och anses utvecklings homolog 28. Intressant modularitet sker där vissa arter, såsom zebrafisk, brist oral och rygg svalget tänder 29, medan andra arter har flera tandade ceratobranchials, pharyngobranchials, och ibland tandade basihyal och hypobranchials 30. I sticklebacks är svalg tänder hittas ventralt på femte ceratobranchial och dorsalt på den främre och bakre pharyngobranchials 31. Kinematik på Pigg utfodring visar den orala käken används främst för byte infångning och underlätta sug utfodring 9 lämnar tugg till svalg käken. I ciklider varierar lägre svalget käken morfologi dramatiskt 32,33 och har visat sig vara adaptiv och korreleras med trofiska nisch 34. MångPLE sötvatten Pigg populationer har utvecklats dramatiska ökningar i ventrala svalg tand nummer 23,35,36. Senaste arbete har visat att utvecklings genetiska grunden för detta utvecklats tand vinst är i hög grad skiljer sig i två oberoende härledda populationer av sötvatten spigg 36. Till skillnad från däggdjurs tänder, fisk regenerera sina tänder kontinuerligt under vuxenlivet 37. Båda dessa tidigare beskrivna höga tandade sötvattenspopulationer har utvecklats en accelererad tandersättningsgrad, vilket ger en sällsynt ryggradsdjur för att studera den genetiska grunden för regenerering 36.
En tredje trofisk drag som har utvecklats flera gånger i sötvatten sticklebacks är längre epibranchial och ceratobranchial ben, de brankiala bågen segmenthomologer av den övre och undre käken, respektive 38. Längre branchial ben ger en större munhålan och sannolikt är adaptiv för att tillåta större byten att vara consumed. Vidare i andra fiskar, epibranchial ben är viktiga för depression av rygg faryngeala tandplattorna 25. Liksom Gälräfständer och svalg tänder, de branchial ben är interna och därmed svårt att enkelt visualisera eller kvantifiera.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att dissekera och platt-montera branchial skelettet, vilket gör det enkelt visualisering och kvantifiering av en rad viktiga kraniofaciala drag. Även om detta protokoll beskriver en spigg dissektion, fungerar denna samma metod på en variation av andra fiskar.
The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.
Sodium Hydroxide (KOH) | EMD | PX1480-1 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | G7893-4L | |
10% Neutral Buffered Formalin (NBF) | Azer Scientific | NBF-4-G | |
Alizarin Red S | EMD | 116-12 | |
Microscope Cover Glasses 22x60mm | VWR | 16004-350 | |
100x10mm Glass Petri Dish | Kimble Chase | 23064-10010 | To dissect samples on |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates |
Modeling Clay | Sargent Art | 22-4000 | 1lb cream |
Scintillation Vials (case of 500) | Wheaton | 66021-668 | Borosilicate Glass with Screw Cap |
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) | FST | 11252-20 | Dumostars are an alternative |
Dissecting Scissors | FST | 15003-08 | Alternate sizes are available depending on size of sample |
Dissecting Microscope | Leica | S6E with KL300 LED | Many other models work nicely, having a flat base helps |
Microcentrifuge Tubes 1.7mL | Denville | C-2170 | |
Cardboard slide tray | Fisher | 12-587-10 |