Disseksjon og Flat-montering av trepigget stingsild Branchial Skeleton

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

En utrolig mengde av mangfold som finnes i hodet skjelettet blant virveldyr, spesielt blant fiskene. I mange tilfeller er dette mangfoldet letter ulike fôringsstrategier ^1-4, og kan innebære store endringer i både ekstern og intern kraniofaciale mønster. Den branchial skjelettet er plassert innvendig i halsen på en fisk og omgir det meste av munnhulen. Den branchial skjelettet består av 5 serielt homologe segmenter, fremre hvorav fire støtter gjellene. Sammen disse fem segmenter fungere som et grensesnitt mellom fisk og maten ^fem. Variasjon i et mangfold av egenskaper, inkludert gill rakers, svelgtann, og branchial bein bidra til effektiv beite på ulike typer mat.

Stingsild har gjennomgått en adaptiv stråling etter forfedrenes oseaniske former kolonis innsjøer og bekker i hele den nordlige halvkule. Skiftet i kostenfra små dyreplankton i havet til større byttedyr i ferskvann har ført til dramatisk trofisk variasjon i flere kraniofaciale trekk ^6. Mens mange studier har fokusert på eksterne kraniofaciale forskjeller i stingsild ^{7 – 13} viktige kraniofaciale endringer utvikle seg gjentatte ganger i den interne branchial skjelettet. Evnen til å skape fruktbare hybrider mellom morfologisk distinkte stingsild populasjoner gir en utmerket mulighet til å kartlegge genetiske grunnlaget for utviklet seg endringer i branchial skjelettet.

En trofisk egenskap av økologisk betydning er fordelingen av gjelle rakers, periodiske dermal bein som linje fremre og bakre ansiktene til branchial bein og brukes til å filtrere byttedyr. Fisk som vanligvis lever av små byttedyr tendens til å ha lengre og tettere mellomrom gill rakers forhold til fisk som lever av større byttedyr ^14,15. Variasjon i gjelle rakers har blitt rapportert både mTVen på og mellom arter ^14-19, og aspekter ved gjelle raker mønster bidra til trofiske nisjer og trenings ^16. Tiår med forskning har grundig dokumentert gjelle raker antall og lengde variasjon i threespine stingsild ^{17 – 21;} Men disse studiene typisk fokusere på den første raden av gill rakers. Nyere arbeider har vist modularitet i den genetiske kontrollen av gill rytterens tall over branchial skjelettet ^22,23 og over en enkelt rad i gjelle raker avstand ²³ og lengde ²⁴ fremhever betydningen av å studere mer enn ro en eller en enkelt gill raker å forstå utviklings genetiske grunnlaget for gill rytterens reduksjon.

En andre trofiske egenskap av både økologisk og biomedisinsk betydning er fordelingen av svelgtann. Tennene i fisk kan ligge både i den orale kjeve og i branchial skjelett, kjent som svelgtann. Oral tenner brukes primært for prey fange mens svelgtann brukes til tygging og byttedyr manipulasjon ^25-27. Begge settene danne via felles utviklingsmekanismer og anses utviklings homolog ^28. Interessant modularitet oppstår der noen arter, for eksempel sebrafisk, mangel muntlig og rygg svelget tenner ^29, mens andre arter har flere tann ceratobranchials, pharyngobranchials, og noen ganger toothed basihyal og hypobranchials ^30. I stingsild, er svelgtann funnet ventralt på den femte ceratobranchial og dorsally på fremre og bakre pharyngobranchials ^31. Kinematikk på stingsild fôring viser oral kjeve brukes primært for byttedyr fangst og legge til rette for suging fôring ⁿⁱ forlater tygging til svelget kjeven. I ciklider, lavere svelget kjeve morfologi varierer dramatisk ^32,33 og har vist seg å være tilpasningsdyktige og korrelert med trofisk nisje ^34. multiple ferskvann stingsild bestander har utviklet seg dramatiske økninger i ventral svelget tann nummer ^23,35,36. Nyere arbeider har vist at utviklings genetiske grunnlaget for dette utviklet seg tann gevinsten er stor grad tydelig i to uavhengig avledet bestander av ferskvanns stingsild ^36. I motsetning til pattedyr tenner, fisk fornye sine tenner kontinuerlig gjennom hele voksenlivet ^37. Begge disse tidligere beskrevet høye tannferskvannsbestander har utviklet en akselerert tann erstatningsrate, noe som gir en sjelden virveldyr system for å studere genetiske grunnlaget for regenerering ^36.

En tredje trofiske egenskap som har utviklet seg gjentatte ganger i ferskvann stingsild er lengre epibranchial og ceratobranchial bein, de branchial bue segment homologer i øvre og nedre kjeve, henholdsvis ^38. Lengre branchial bein gi en større munnhulen og trolig er adaptive for å tillate større byttedyr å være consumed. Videre i annen fisk, epibranchial bein er viktig for depresjonen i rygg svelget tannplatene ^25. Som gill rakers og svelgtann, de branchial bein er interne og dermed vanskelig å enkelt visualisere eller tallfeste.

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å dissekere og flat-montere branchial skjelettet, noe som gir enkel visualisering og kvantifisering av en rekke viktige kraniofaciale egenskaper. Mens denne protokollen beskriver en stingsild disseksjon, fungerer den samme metoden på en rekke andre fisker.

Protocol

All fisk arbeidet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California i Berkeley (protokoll nummer R330). Eutanasi ble utført ved anvendelse av nedsenkning i 0,025% Tricaine-S bufret med 0,1% natrium-bikarbonat 39. Alle trinn utføres ved romtemperatur. 1. Forberedelse Merk: Utfør trinn 1,1-1,5 i koniske rør eller scintillasjonsglass som kan forsegle tett og bli lagt horisontalt. Fisk trenger ikke å være konstant rystet, men forsøke å blande løsningen s…

Representative Results

Denne protokollen gir en dissekert og flat montert branchial skjelett (figur 4), hvor en rekke viktige trofiske egenskaper kan kvantifiseres. Fra en dorsal visning, kan alle rader av gjelle rakers, alle svelget tann plater, og nesten alle branchial bein være lett visualisert og kvantifisert 22 – 24,35,36,38,42. Alizarin Red S fluorescerer også på en rhodamin eller lignende rødt filter som tillater dobbel merking med andre markø…

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10