Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo que avalia as alterações da sensibilidade do miofilamento Ca²⁺ durante a contração em miócitos cardíacos isolados do coração de ratos. Juntamente com a eletrofisiologia cardíaca, os níveis sistólicos/diastólicos de citosol Ca²⁺ e a contração/relaxamento, essa medição é imperativa para sustentar os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaca em corações saudáveis e doentes.

Resumo

insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No entanto, o mecanismo de patogênese e mau funcionamento do miocárdio no coração doente continua a ser totalmente esclarecido. Provas convincentes recente demonstra que as mudanças na miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade afetam Ca ²⁺ intracelular atividades homeostase e canais iônicos em miócitos cardíacos, os mecanismos essenciais responsáveis ​​pelo potencial de ação cardíaco e contração em corações saudáveis ​​e doentes. De facto, as actividades dos canais de iões e transportadores subjacentes potenciais de acção cardíaca (por exemplo, Na ^+, Ca ²⁺ e os canais de K ⁺ e Na ⁺ -Ca ²⁺⁾ e proteínas de permutador de Ca ²⁺ intracelular de manuseamento (por exemplo., Os receptores de rianodina e Ca ^{2 +} -ATPase no retículo sarcoplasmático (SERCA2a) ou fosfolambam e a sua fosforilação) são convencionalmente medido para avacomeu os mecanismos fundamentais do acoplamento excitação-contração cardíaca (CE). Ambas as atividades elétricas na membrana e Ca ²⁺ alterações intracelulares são os sinais de disparo de acoplamento CE, enquanto miofilamentos é a unidade funcional de contração e relaxamento, e miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade é imperativo na implementação de desempenho miofibrila. No entanto, poucos estudos incorporar miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade para a análise funcional do miocárdio, a menos que é o foco do estudo. Aqui, descrevemos um protocolo que mede sarcomere encurtamento / re-alongamento eo nível ^{de Ca2 +} intracelular usando Fura-2 AM (detecção ratiometric) e avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca ²⁺ em miócitos cardíacos de corações de ratos. O principal objetivo é enfatizar que miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade deve ser levado em consideração no acoplamento CE para análise mecanicista. investigação detalhada do iem canais, transportadores iônicos, intracelular de manipulação ^{de Ca2 +,} e miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade que fundamentam a contratilidade dos miócitos em corações saudáveis ​​e doentes irá fornecer informações valiosas para a concepção de estratégias mais eficazes de translação e valor terapêutico.

Introdução

Acoplamento de excitação-contracção cardíaca (CE) é o esquema fundamental para analisar as propriedades mecânicas do miocárdio, ou seja, a função contráctil do coração ^1,2. CE de acoplamento é iniciado pela despolarização da membrana secundária para as actividades dos canais de iões de sarcolema (por exemplo, a voltagem-canal de Na ^+, que pode ser medido através de técnicas de patch-clamp). Activação subsequente do tipo L dependentes da voltagem canais de ^{Ca2 +} (LTCCs) e influxo de ^{Ca2 +} através LTCCs desencadear a grandes quantidades de libertação ^{de Ca2 +} através dos receptor....

Protocolo

O protocolo está de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais da ONU de Saúde (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996). Foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Seul (aprovação IACUC no .: SNU-101213-1).

1. Tampão de Preparação (Materiais de mesa e equipamentos)

1. Preparar 300 ml de solução de isolamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; _MgCl2, 3,5; glicose, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 com NaOH).
2. Preparação de 100 ml de....

Resultados

miócitos do VE são isolados de corações normais e hipertensos ratos. Miócitos em forma de haste com estrias claras (representando sarcómeros) e contracções estáveis ​​em resposta à estimulação do campo são considerados os miócitos óptimos e são seleccionados para gravações (Figura 2A). No exemplo mostrado na F igura 2A, uma Fura 02:00 -loaded miócitos está posicionado horizontalmente e a abertura da câmara é ajustado de modo que o miócito ocupa a maior p.......

Discussão

Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca ²⁺ em um único miócitos cardíacos isolados e enfatizar a importância de se medir este parâmetro juntamente com propriedades eletrofisiológicas, intracelulares ^{de Ca2 +} transientes, ea dinâmica dos miofilamentos. Isto é porque as gravações de um ou dois dos parâmetros não podem explicar os mecanismos subjacentes a contracção cardíaca e relaxamento. Ao contrário dos métodos convencionais que medem a contr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rato Sprague Dawley	Koatech		8-12 semanas
Pentobarbital Sódico	Hanlim Pharmaceutical (Coréia)	AHN901	Código de seguro: 645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH < sub>2< / sub>PO4< / sub>	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glicose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Manitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sódio Pyruvate	Sigma	P2256
Taurina	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4  < / sub>	Sigma	71649
Albumina Fetal Bovina	Sigma	A7906
Colgenase Tipo 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Sondas Moleculares	F1221
Pluronic F127 Solução a 20% em DMSO	Invitrogen	P3000MP
Banho-maria agitado	Chang Shin Modelo científico	: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Construtor experimental	Aquisição e análise de dados de acoplamento EC em miócitos
miócitos cálcio e Sistema de Registro de Contratilidade	IonOptix Ltd
Banho-maria Circulante	BS-Tech	BW2-8
Microscópio de Fluorescência de Miócitos	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescência & Detecção de vídeo	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescência e Interface do sistema	IonOptix	FSI700
	IonOptix	mSTEP
Lâmpada ARC de alta intensidade Fonte de alimentação	Cairn Reseach
Filter controlador de roda	IonOptix	GB / MUS200
Estimulador digital	Sistemas médicos Corportion	S-98 Mutimode
Composições de Soluções Experimentais
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Solução de Isolamento (pH: 7,4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentração (mmol) 135
Concentração KCl	Sigma	P4504	(mmol) 5.4
Concentração HEPES	Sigma	H3375	(mmol) 5
Concentração de	glicose	Sigma G8270	(mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentração (mmol) 3.5
de CB2742654	Sigma	taurina (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentração (mmol) 0.4
Solução de armazenamento (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentração (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentração (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentração (mmol) 10
Glicose	Sigma	G8270	Concentração (mmol) 5,5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentração (mmol) 0,2
Manitol	Sigma	M4125	Concentração (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentração (mmol) 5
Piruvato de Sódio	Sigma	P2256	Concentração (mmol) 5
	Taurina Sigma	Concentração CB2742654	(mmol) 20
Solução de perfusão (solução de tirodo, pH: 7,4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentração (mmol) 141,4
KCl	Sigma	P4504	Concentração (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentração (mmol) 0,33
Concentração HEPES	Sigma	H3375	(mmol) 10
Glicose	Concentração Sigma	G8270	(mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	Concentração C2002	(mmol) 1.8          Para o carregamento Fura 2AM, as concentrações de CaCl2 são 0,25 mM e 0,5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentração (mmol) 1
Manitol	Sigma	M4125	Concentração (mmol) 14,5
Solução de Collangenase 1
Solução de Isolamento (30mL)
Albumina Fetal Bovina (solução BSA 5 ml)			Concentração (mmol) 1,67 mg/mL
de colagenase tipo 2	Worthington	LS004177	Concentração (mmol) 1 mg/mL
de protease	Sigma	P6911	Concentração (mmol) 0,1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentração (mmol) 0,05 mM
Solução de colangenase 2
Solução de isolamento ( 20mL)
Albumina Fetal Bovina (solução BSA 3,3 mL)			Concentração (mmol) 1,67 mg / mL
Colagenase Tipo 2	Worthington	LS004177	Concentração (mmol) 1 mg / mL
CaCl2< / sub>	Biosesang	C2002	Concentração (mmol) 0,05 mM
Solução
Solução de Isolamento ( 40mL)
Albumina Fetal	Bovina Sigma	A7906	Concentração (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentração (mmol) 1mM

Fonte de luz de excitação Concentração BSA