Vurdering av Myofilament Ca²⁺ Følsomhet underliggende hjerte Eksitasjon-kontraksjon Coupling

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

Hjertesvikt og hjerterytmeforstyrrelser er de viktigste årsakene til dødelighet og sykelighet på verdensbasis. Imidlertid fortsatt mekanismen for patogenesen og hjerteinfarkt feil i den syke hjerte til å bli avklart. Nyere overbevisende bevis viser at endringer i myofilament Ca ²⁺ følsomhet påvirke intracellulær Ca ²⁺ Homeostase og ionekanal aktiviteter i hjertemuskelceller, de grunnleggende mekanismene som er ansvarlig for hjertets aksjonspotensial og sammentrekning hos friske og syke hjerter. Faktisk aktiviteter ionekanaler og transportører underliggende hjerteaksjonspotensialer (f.eks Na ^+, Ca ²⁺ og K ⁺ -kanaler og Na ⁺ -CA ²⁺ leren) og intracellulære Ca ²⁺ håndtering proteiner (f.eks., Ryanodine reseptorer og Ca ²⁺ -ATPase i sarkoplasmatisk retikulum (SERCA2a) eller phospholamban og dens fosforylering) blir vanligvis målt til å evaluspiste de grunnleggende mekanismene for hjerte eksitasjon-kontraksjon (EF) kobling. Både elektriske aktiviteter i membranen og intracellulære Ca ²⁺ endringene er trigger signaler om EF kopling, mens myofilament er funksjonell enhet av sammentrekning og avslapping, og myofilament Ca ²⁺ følsomhet er viktig i gjennomføringen av myofibril ytelse. Likevel er det få studier innlemme myofilament Ca ²⁺ følsomhet til funksjonell analyse av hjertemuskelen med mindre det er fokus for studien. Her beskriver vi en protokoll som måler sarcomere forkortelse / re-forlengelse og den intracellulære Ca ²⁺ nivå ved hjelp av Fura-2 AM (ratiometrisk deteksjon) og vurdere endringer av myofilament Ca ²⁺ følsomhet i hjertemuskelceller fra rottehjerter. Hovedmålet er å understreke at myofilament Ca ²⁺ følsomhet bør tas hensyn til i EF kopling for mekanistisk analyse. Omfattende etterforskning av ipå kanaler, ion transportører, intracellulær Ca ²⁺ håndtering og myofilament Ca ²⁺ følsomhet som ligger til grunn myocyte kontraktilitet hos friske og syke hjerter vil gi verdifull informasjon for å designe mer effektive strategier for translasjonsforskning og terapeutisk verdi.

Introduction

Cardiac eksitasjon-kontraksjon (EC) kobling er den grunnleggende skjema for analyse av mekaniske egenskapene til hjertemuskelen, dvs. den kontraktile funksjon av hjertet ^1,2. EF kopling er initiert av membran depolarisering sekundært til aktiviteter sarcolemmal ionekanaler (f.eks spenningsstyrte Na ⁺ kanal, som kan måles via patch-clamp teknikker). Påfølgende aktivering av de spenningsstyrte L-type Ca ²⁺ kanaler (LTCCs) og Ca ²⁺ tilstrømningen via LTCCs utløse parten av Ca ²⁺ frigjøring gjennom ryanodine reseptorer (RyRs), øker cytosoliske Ca ²⁺ konsentrasjon fra nanomolar (nM ) mikromolar (uM) nivå. En slik økning i cytosol-Ca ²⁺ fremmer Ca ^{2 +} binding til troponin C (TNC) i tynne filamenter og utløser konformasjonsendringer av filamentet komplekset for å lette den aktin-myosin interaksjon og oppnår myocardial sammentrekning ^tre. Omvendt, cytosoliske Ca ²⁺ gjen uptaken tilbake inn i det sarkoplasmatiske retikulum (ER) via Ca2 ⁺ -ATPase i SR (SERCA2a) eller ekstruderes ut av muskelceller via Na ⁺ / Ca2 ⁺ veksleren og den plasmalemmal Ca ²⁺ ATPase ^1,2. Følgelig nedgangen i cytosolisk Ca2 ⁺ setter i gang konformasjonsendringer av tynne filamenter tilbake til den opprinnelige tilstand, noe som resulterer i dissosiasjonen av aktin-myosin og myocyte avslapping ^1-3. I denne ordningen, er aktiviteten til SERCA2a generelt ansett for å bestemme hastigheten av hjerteinfarkt avslapping fordi den står for 70-90% av cytosoliske Ca ²⁺ fjerning i de fleste pattedyr hjertet celler ^1. Som sådan, unormal Ca ²⁺ håndtering av LTCC, RyR og SERCA2a, etc. har blitt ansett som den viktigste mekanismer for svekket kontraktilitet og avslapning i den syke hjertet ^1-4.

<p class="jove_content"> I virkeligheten gratis cytosolic Ca ²⁺ som fungerer som budbringer i EF koblings står for rundt 1% av total intracellulær Ca ²⁺ og flertallet av Ca ²⁺ er bundet til intracellulære Ca ^{2 +} buffere ^5,6. Dette skyldes det faktum at ulike Ca ^{2 +} buffere er rikelig i hjertemuskelceller, for eksempel membran fosfolipider, ATP, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, myosin, SERCA2a, og calsequestrin i SR. ^5,6,7. Blant dem, SERCA2a og TNC er de dominerende Ca ^{2 +} buffere ^5,6,7. Videre Ca ²⁺ binding til sine buffere er en dynamisk prosess i rykk (f.eks 30-50% av Ca ²⁺ binder seg til TNC og distansere seg fra den i løpet Ca ^{2 +} transienter ⁷⁾ og endring i Ca ²⁺ bindende årsaken ekstra "release" av fri Ca2 ⁺ til cytosol, resulterer i forandringer av intracellulær Ca ^{2 +} konsentration. Følgelig forstyrrelse av den intracellulære Ca ²⁺ nivå induserer unormale myofilament bevegelser, som er forløperne til kontraktile dysfunksjon og arytmier ^8,9. Mange faktorer (både fysiologiske og patologiske) kan være kilder til post-transcriptional modifikasjoner av myofilament proteiner, som påvirker myofilament Ca ²⁺ buffering og myofilament Ca ²⁺ følsomhet ^8-10. Nylig ble det rapportert at mutasjoner i myofilament proteiner øke Ca ²⁺ bindende affinitet og intracellulær Ca ²⁺ håndtering, utløser pause avhengig forsterkning av Ca ²⁺ transienter, unormal Ca ²⁺ utslipp og arytmier ^8. I tråd med dette konseptet, har vi også vist at myofilament Ca ^{2 +} reduksjon av følsomhet hos hypertensive rottehjerter sekundære til den opp-regulering av nevronal nitrogenoksid syntase er assosiert med forhøyet diastolisk og systolisk Ca ²⁺ nivåer^11, som i sin tur øker sårbarheten i LTCC til Ca ²⁺ -avhengige inaktive ^12. Derfor er myofilament Ca2 ⁺ følsomhet en "aktiv" regulator av intracellulær Ca2 ⁺ homeostase og myocyte kontraktile funksjon. Det har blitt nødvendig å analysere samspillet mellom myofilament og Ca ²⁺ håndtering proteiner for grundig undersøkelse av myocyte EF kopling og hjertefunksjon.

Her beskriver vi en protokoll som vurderer endringer av myofilament Ca ²⁺ følsomhet i isolerte hjertemuskelceller. Omfattende analyse av intracellulær Ca ²⁺ profil, vil myofilament Ca ²⁺ følsomhet og sammentrekning grave opp nye mekanismer underliggende hjerteinfarkt mekanikk.

Protocol

Protokollen er i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr publisert av FNs National Institutes of Health (NIH publikasjon nr 85-23, revidert 1996). Den ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Seoul National University (IACUC godkjenning nr .: SNU-101213-1). 1. Buffer Forberedelse (Tabell Materialer og utstyr) Fremstille 300 ml frisk isolasjon løsning på dagen for eksperimentet (i mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glukose, …

Representative Results

LV muskelceller er isolert fra normale og hypertensive rottehjerter. Stavformede muskelceller med klare striper (som representerer sarcomeres) og stabile sammentrekninger i respons til felt stimulering anses å være de optimale muskelceller og er valgt for opptak (figur 2A). I det eksempel som er vist i f-igur 2A, en Fura 2-am -loaded LV myocyte er plassert horisontalt og åpningen av kameraet er justert slik at den myocyte opptar mesteparten av opptaks…

Discussion

Her beskriver vi protokollene for å vurdere endringer av myofilament Ca ²⁺ følsomhet i enkelt isolert hjerte myocyte og understreker viktigheten av å måle denne parameteren sammen med elektrofysiologiske egenskaper, intracellulære Ca ^{2 +} transienter, og myofilament dynamikk. Dette er fordi opptakene av en eller to av parametrene ikke kan explicate mekanismene bak hjerte- sammentrekning og avslapping. I motsetning til konvensjonelle fremgangsmåter som måler myocyte sammentrekning og den intra…

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM