This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.
Hjärtsvikt och hjärtarytmier är de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet i världen. Dock kvarstår mekanismen för patogenes och hjärtinfarkt fel i sjuka hjärta till fullo klar. Senaste övertygande bevis för att förändringar i myofilament Ca2 + känslighet påverkar intracellulär Ca2 + homeostas och jonkanal aktiviteter i hjärtmyocyter, de grundläggande mekanismer som ansvarar för hjärtaktionspotentialen och kontraktion hos friska och sjuka hjärtan. Faktum är att verksamheten i jonkanaler och transportörer underliggande hjärtaktionspotentialer (t.ex. Na +, Ca2 + och K + -kanaler och Na + -Ca 2+ växlar) och intracellulära Ca2 + hanterings proteiner (t ex., Ryanodinreceptorer och Ca 2+ -ATPas i sarkoplasmatiska retiklet (SERCA2a) eller fosfolamban och dess fosforylering) konventionellt mätas för att utvärdeåt de grundläggande mekanismerna av hjärt excitation-kontraktion (EG) koppling. Båda elektriska aktiviteter i membranet och intracellulära Ca2 + förändringar är utlösarsignaler i EG koppling, medan myofilament är den funktionella enheten av sammandragning och avslappning, och myofilament Ca2 + känsligheten är absolut nödvändigt för att genomföra myofibrill prestanda. Ändå är det få studier införliva myofilament Ca2 + känslighet till den funktionella analysen av hjärtmuskeln om det inte är i fokus för studien. Här beskriver vi ett protokoll som mäter sarcomere förkortning / re-förlängning och den intracellulära Ca2 + nivå med Fura-2 AM (ratiometrisk detektering) och utvärdera förändringarna i myofilament Ca2 + känslighet i hjärtmuskelceller från råtthjärtan. Huvudsyftet är att understryka att myofilament Ca2 + känsligheten bör beaktas i EG koppling för mekanistiska analys. Omfattande undersökning av ipå kanaler, jon transportörer, intracellulär Ca2 + hantering och myofilament Ca2 + känslighet som ligger bakom myocyt kontraktilitet hos friska och sjuka hjärtan kommer att ge värdefull information för att utforma mer effektiva strategier för translationell och terapeutiskt värde.
Cardiac excitation-kontraktion (EG) koppling är den grundläggande systemet för analys av mekaniska egenskaper hos myokardiet, dvs., den kontraktila funktionen av hjärtat 1,2. EG koppling initieras genom membrandepolarisering sekundärt till verksamhet sarcolemmal jonkanaler (t.ex. den spänningsstyrda natriumkanalen, som kan mätas via patch-clamp teknik). Efterföljande aktivering av spänningskänsliga L-typ Ca2 + kanaler (LTCCs) och Ca 2+ inflöde via LTCCs utlösa huvuddelen av Ca2 + frisättning genom ryanodinreceptorer (RyRs), vilket ökar den cytosoliska Ca2 + -koncentration från nanomolar (nM ) mikromolar (^ M) nivå. En sådan ökning av cytosoliskt Ca2 + främjar Ca2 + bindning till troponin C (TNC) i tunna filament och framkallar konformationsförändringar på glöd komplexet för att underlätta aktin-myosin interaktion och uppnår myocardial kontraktion 3. Omvänt cytosoliska Ca 2 + åter uptaken tillbaka in i sarkoplasmatiska retiklet (SR) via Ca2 + ATPas i SR (SERCA2a) eller pressas ut ur myocyt via Na + / Ca2 + värmeväxlare och plasmalemmal Ca2 + ATPas 1,2. Följaktligen nedgången i cytosoliskt Ca2 + anstiftar konformationsförändringar av tunna trådar tillbaka till det ursprungliga tillståndet, vilket resulterar i dissociation av aktin-myosin och myocyt avkoppling 1-3. I detta system är aktiviteten hos SERCA2a allmänt anses bestämma hastigheten av myocardial avkoppling eftersom den står för 70-90% av cytosoliskt Ca2 + borttagning i de flesta däggdjurshjärtceller 1. Som sådan onormal Ca2 + hantering av LTCC, Ryr och SERCA2a, etc. har ansetts de primära mekanismerna för nedsatt kontraktilitet och avkoppling i det sjuka hjärtat 1-4.
<p class="jove_content"> I verkligheten fri cytosoliskt Ca2 + som fungerar som budbärare i EG-kopplings står för cirka 1% av den totala intracellulära Ca2 + och majoriteten av Ca2 + är bunden till intracellulära Ca 2 + buffertar 5,6. Detta beror på det faktum att olika Ca2 + buffertar finns rikligt i hjärtmyocyter, t.ex., membranfosfolipider, ATP, phosphocreatine, kalmodulin, parvalbumin, myofibrill TNC, myosin, SERCA2a och calsequestrin i SR. 5,6,7. Bland dem, SERCA2a och TNC är de dominerande Ca2 + buffertar 5,6,7. Dessutom 2+ bindning till dess buffertar är Ca en dynamisk process under rycka (t.ex. binder 30-50% av Ca2 + till TNC och separera från det under Ca2 + transienter 7) och förändringen i Ca2 + bindning orsakar ytterligare "släppa" av fri Ca2 + till cytosolen, resulterar i förändringar av den intracellulära Ca2 + koncentration. Följaktligen störning av den intracellulära Ca2 + nivå framkallar onormala myofilament rörelser, som är föregångare till kontraktil dysfunktion och arytmier 8,9. Många faktorer (både fysiologiska och patologiska) kan vara källor till posttranskription modifieringar av myofilament proteiner som påverkar myofilament Ca2 + buffring och myofilament Ca2 + känslighet 8-10. Nyligen rapporterades det att mutationer i myofilament proteiner ökar Ca2 + bindningsaffiniteten och intracellulär Ca2 + hantering, utlöser paus beroende förstärkning av Ca2 + transienter, onormal Ca2 + frisättning, och arytmier 8. I linje med detta koncept, har vi också visat att myofilament Ca2 + hyposensibilisering hos hypertensiva råtthjärtan sekundära till uppreglering av neuronal kväveoxidsyntas är förknippad med förhöjda diastoliskt och systoliskt Ca2 + nivåer11, vilket i sin tur ökar sårbarheten i LTCC till Ca2 + -beroende inaktive 12. Följaktligen är myofilament Ca 2 + känslighet en "aktiv" regulator av intracellulär Ca2 + homeostas och myocyt kontraktil funktion. Det har blivit nödvändigt att analysera interaktioner mellan myofilament och Ca2 + hanterings proteiner för grundlig utredning av myocyt EG koppling och hjärtfunktion.Här beskriver vi ett protokoll som bedömer förändringarna i myofilament Ca2 + känsligheten i isolerade hjärtmyocyter. Omfattande analys av intracellulär Ca2 + profil kommer myofilament Ca2 + känslighet och kontraktion gräva nya mekanismer underliggande hjärt mekanik.
Här beskriver vi de protokoll för att bedöma förändringar av myofilament Ca2 + känslighet i en enda isolerad hjärt myocyte och betonar vikten av att mäta denna parameter tillsammans elektrofysiologiska egenskaper, intracellulära Ca2 + transienter, och myofilament dynamik. Detta beror på att inspelningar av en eller två av de parametrar som inte kan explicate mekanismerna bakom hjärtsammandragning och avkoppling. Till skillnad från konventionella metoder som mäter myocyte kontraktion o…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (2013068067); av hjärnan Korea 21 Graduate Program för koreanska ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik, Seoul National University Hospital, den koreanska Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (nr. 3420130290) och från National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
NaCl | Sigma | S9625 | |
KCl | Sigma | P4504 | |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
MgSO4 | Sigma | M5921 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
Protease | Sigma | P6911 | |
Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
MyoCam-S Power | IonOptix | ||
Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
CFA300 | |||
PMT400 | |||
Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
Compositions of Experimental Solutions | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
Collangenase Solution 1 | |||
Isolation Solution (30mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
Collangenase Solution 2 | |||
Isolation Solution (20mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
BSA solution | |||
Isolation Solution (40mL) | |||
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |