An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
Målet med denne protokollen er å beskrive molekylære endringer i menneskelige diabetiske hornhinner og vise hvordan de kan lindres ved adenovirus genterapi i organ kultivert hornhinner. Den diabetiker hornhinnen sykdom er en komplikasjon av diabetes med hyppige abnormiteter i hornhinnen nerver og epitel sårtilheling. Vi har også dokumentert betydelig endret uttrykk for flere mulige epiteliale stamcellemarkører i menneskelige diabetiske hornhinner. For å avhjelpe disse endringene ble adenovirus genterapi implementert ved hjelp av oppregulering av c-met proto-onkogen ekspresjon og / eller nedregulering av proteinaser matriksmetalloproteinase-10 (MMP-10) og cathepsin F. Denne terapien akselerert sårheling hos diabetiske hornhinner selv når bare den limbale stamcellelinjen ble transdusert. De beste resultater ble oppnådd med kombinert behandling. For mulig pasienten transplantasjon av normaliserte stamceller, er et eksempel presenteres også av optimizatipå av genet transduksjon i stamcelle-anrikede kulturer ved hjelp av polykationiske enhancere. Denne tilnærmingen kan være nyttig ikke bare for de utvalgte gener, men også for de andre mediatorer av hornhinneepitel sårtilheling og stamcellefunksjon.
Den diabetiske hornhinnen sykdom resulterer hovedsakelig i degenerative epitel (keratopathy) og nerve (nevropati) endringer. Det er ofte manifestert av de unormalt av epitel sårtilheling og hornhinnen nerve reduksjon 1-4. Anslagsvis 60-70% diabetikere har ulike hornhinneproblemer 1,3. Våre studier har identifisert flere markørproteiner med endret ekspresjon i humane diabetiske hornhinner herunder nedregulering av c-met proto-onkogen (hepatocytt-vekstfaktor-reseptor) og oppregulering av matriksmetalloproteinase-10 (MMP-10) og cathepsin F 5, 6. Vi har også dokumentert betydelig redusert uttrykk for flere mulige epiteliale stamcellemarkører i den menneskelige diabetiske hornhinner.
I de tidligere studiene har vi utviklet en adenoviral basert genterapi for å normalisere nivået av diabetes forandret markører under anvendelse av human diabetiker korneal organkultursystem, som viser langsom sårtilheling, diabetiskmarkør endringer, og stamcelle markør uttrykk reduksjon lik ex vivo hornhinner 7,8. Dette utholdenhet av endringer synes å være på grunn av eksistensen av epigenetisk metabolsk minne 9. Dette kultursystemet ble videre brukt for genterapi. Målene for denne behandlingen ble valgt fra markører med enten redusert uttrykk hos diabeteshornhinner (c-met proto-onkogen), eller økt uttrykk (MMP-10 og cathepsin F).
Den adenovirale (AV) terapi ble brukt i hele organ dyrket hornhinner eller corneoscleral omkrets limbale seksjonen kun. Dette rommet havner epiteliale stamceller som fornyer hornhinnen epitel og delta aktivt i sårheling 4,10-15. Her blir protokoller gitt for normal og diabetisk human korneal organkultur, epitelial sårheling, isolering og karakterisering av stamcelleanriket limbale cellekulturer, og adenoviral celle og hornhinnen transduksjon. VårResultatene viser gjennomførbarheten av denne behandlingen for å normalisere markør uttrykk og sårheling hos diabeteshornhinner for mulig fremtidig transplantasjon. De foreslår også at kombinasjonsterapi er den mest effektive måten å gjenopprette normal markør mønster og epitel helbredelse i diabetiker hornhinnen 16-18.
Hornhinnen ser ut til å være et ideelt vev for genterapi på grunn av sin overflate sted hvor den genavlevering, så vel som vurdering av effekt og bivirkninger, er lett. Imidlertid er en klinisk oversettelse av denne kraftige metoden fortsatt langsom på grunn av knappe informasjon om genetiske årsaker hornhinnen sykdommer og de genterapeutiske målene 24. Diabetiske komplikasjoner inkludert hornhinne endringene kan være i stor grad epigenetisk i naturen, som oversettes til metabolsk minne 9.<…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |