Коррелятивное световой и электронной микроскопии для изучения микроглии взаимодействий с бета-амилоидных бляшек
Summary
В данной статье описывается протокол для визуализации амилоидных бляшек A & beta; в мышиных моделях болезни Альцгеймера с помощью метокси-X04, который пересекает гематоэнцефалический барьер и избирательно связывается с бета-складчатые листы, найденные в плотном ядре A & beta бляшек. Это позволяет предварительный отбор срезов ткани зубной налет, содержащий до иммунной окраски и обработки для электронной микроскопии.
Abstract
Подробный протокол приводится здесь для выявления амилоида A & beta; бляшек в срезах мозга от мышиных моделей болезни Альцгеймера до того перед вложением иммуноокрашивания (специально для ионизированного кальция связывания адаптера молекулы 1 (Iba1), кальций-связывающий белок выражается микроглии) и обработки тканей для электронная микроскопия (ЭМ). Метокси-X04 представляет собой флуоресцентный краситель, который пересекает гематоэнцефалический барьер и избирательно связывается с бета-плиссе листов найдены в плотном ядре A & beta бляшек. Инъекция животных с метокси-X04 до умерщвления и фиксации мозга позволяет предварительный отбор и отбор бляшек, содержащих срезов мозга для дальнейшей обработки с трудоемких манипуляций. Это особенно полезно при изучении ранней патологии AD в пределах определенных областей головного мозга или слоев, которые могут содержать очень мало бляшек, присутствующих в лишь небольшая часть из секций. обработка Посмертное срезов ткани Конго красным Тиофлавин S и ThioflAvin T (или даже с метокси-x04) может пометить бета-складчатой листов, но требует обширных клиринг с этанолом для удаления избытка красителя и эти процедуры несовместимы с сохранением ультраструктурным. Было бы также неэффективным для выполнения маркировки на A & beta; (и других клеточных маркеров, таких как Iba1) на всех участках мозга из регионов, представляющих интерес, только, чтобы получить небольшую фракцию, содержащую A & beta; бляшками в нужном месте. Важно отметить, что Ар бляшек все еще видны после обработки ткани для ЭМ, что позволяет для точной идентификации областей (как правило, до нескольких квадратных миллиметров) для изучения с помощью электронного микроскопа.
Introduction
Амилоида A & beta; формирование бляшек является основным нейропатологических признаком болезни Альцгеймера (AD). Тем не менее все больше доказательств свидетельствует о важной роли иммунной системы в прогрессировании заболевания у детей в 1,2 раза . В частности, новые данные из доклинических и клинических исследований установлено, дисфункции иммунной системы в качестве основного водителя и вкладчика в AD патологии. С этими выводами, центральной и периферической иммунные клетки появились в качестве перспективных терапевтических мишеней для 3 AD. Следующий протокол сочетает в себе световой и электронной микроскопии (ЭМ) для создания новое понимание взаимосвязи между Ар осаждения бляшек и микроглии фенотипических изменений в AD. Этот протокол позволяет маркировать A & beta ; бляшек в мышиных моделях AD с использованием в естественных условиях инъекции флуоресцентного красителя метокси-X04. Метокси-X04 является конго красным производным инструментом, который может легко пересечь гематоэнцефалический барьер, чтобы войти в паренхиму мозга и связывать β-складчатой листы с высокой аffinity. Поскольку краситель флуоресцентный, он может быть использован для обнаружения в естественных условиях осаждения бляшек Ар с двухфотонной микроскопии 4. После того, как связан с A & beta;, метокси-X04 не диссоциирует или перераспределить от бляшек, и он сохраняет свою флуоресценцию с течением времени. Это , как правило , вводят периферически , чтобы позволить неинвазивной визуализации динамики мозга 5. Флуоресценции также остается следующая альдегидной фиксации, что позволяет анализирует соотносительны некропсический, включая расследование гибели нейронов в районе Ар бляшек 6.
Этот протокол использует свойств метокси-X04 , чтобы выбрать разделы мозга от APP SWE / PS1A 246E мышей (APP-PS1; совместной экспрессии двойной мутации в APP гене Lys670Asn / Met671Leu и вариант пресенилин PS1-A264E человек) 7 , которые проявляют A & beta бляшки в конкретных регионах, представляющих интерес (гиппокампа СА1, пластового radiatum и lacunosum-moleculare) До предварительно встраивания иммуноокрашивания против микроглии маркера ионизированного кальция связывающей молекулы адаптер 1 (Iba1) для визуализации микроглии органы и процессы с EM клеток. Мышам дают внутрибрюшинную инъекцию раствора метокси-x04, 24 ч до начала фиксации мозга через transcardial перфузией. Коронарные срезы мозга получены с использованием vibratome. Разделы, содержащие гиппокампа CA1 подвергают скринингу под флуоресцентным микроскопом на наличие бляшек A & beta; в слоях radiatum и lacunosum-moleculare. Иммуногистохимическое Iba1, четырехокись осмия после фиксации и пластиковой смолы вложение затем выполняются на отдельных участках мозга. В конце этого протокола, секции могут быть сохранены без дальнейшей деградации ультраструктурным, готовый к ультратонкой секционирования и ультраструктурным экспертизы. Важно отметить, что бл шки еще флуоресцентный после иммунным с различными антителами, например Iba1, как в настоящем протоколе. Они становятся темнее, тхань окружающих их нейропиля следующие четырехокись осмия после фиксации, независимо от метокси-X04 окрашивания, что позволяет точно определить регионы, представляющие интерес, как правило, до нескольких квадратных миллиметров, чтобы быть исследованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа.
Этот соотносительны подход предлагает эффективный способ идентификации конкретных участков мозга для изучения на ультраструктурном уровне. Это особенно полезно при изучении ранней патологии AD, в пределах определенных областей головного мозга или слоев, которые могут содержать только несколько A & beta; бляшками, присутствует только небольшая часть срезов ткани. В это время особенно, было бы неэффективно использовать иммуногистохимическое (A & beta; и двойной маркировки для других клеточных маркеров, таких как Iba1) на нескольких срезах мозга просто, чтобы получить небольшую фракцию, содержащую A & beta; бляшками в нужном месте. Кроме того, инъекции живых мышей с метокси-X04 перед умерщвлением и обработки тканей не Специальное соглашениеЕ ультраструктурную сохранение. Альтернативные методы , такие как посмертного окрашивания Конго красным Тиофлавин S, Тиофлавин T или метокси-X04 на участках фиксированных тканей требуют окрашивания дифференциации в этаноле, 8-11 , который вызывает осмотический стресс и разрушает ультраструктуры. Конго красный также является известным канцерогеном для человека 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол объясняет корреляционный подход к ориентации плотного ядра A & beta; бляхи с ЕМ. Метокси-X04 в естественных условиях инъекции позволяет быстро выбор участков мозга , которые содержат A & beta ; бляшками в пределах отдельных регионов и слоев , представляющих интерес, напри…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer’s disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
