متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني لدراسة دبقية التفاعل مع اللوحات-β اميلويد
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول لتصور اميلويد لويحات Aβ في نماذج الفئران مرض الزهايمر باستخدام ميثوكسي-X04، الذي يعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي يربط بيتا-مطوي أوراق وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. فإنه يسمح الفرز المسبق من أقسام الأنسجة التي تحتوي على لوحة قبل المناعية وتجهيز المجهر الإلكتروني.
Abstract
ويرد بروتوكول مفصلة هنا لتحديد اميلويد لويحات Aβ في أقسام الدماغ من نماذج الماوس مرض الزهايمر قبل المناعية تضمين ما قبل (على وجه التحديد لالمتأين ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (IBA1)، وهو بروتين ملزمة الكالسيوم التي أعرب عنها الخلايا الدبقية الصغيرة) ومعالجة الأنسجة ل المجهر الإلكتروني (EM). ميثوكسي-X04 هو صبغة الفلورسنت التي تعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي بربط أوراق بيتا مطوي وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. حقن الحيوانات مع ميثوكسي-X04 قبل للتضحية وتثبيت الدماغ يسمح الفرز المسبق واختيار من أقسام الدماغ التي تحتوي على لوحة لمزيد من المعالجة مع التلاعب تستغرق وقتا طويلا. وهذا مفيد بشكل خاص عند دراسة علم الأمراض في وقت مبكر م ضمن مناطق محددة في الدماغ أو الطبقات التي قد تحتوي على عدد قليل جدا من لويحات والحاضر إلا في جزء صغير من الأقسام. معالجة ما بعد الوفاة من أقسام الأنسجة مع الكونغو الأحمر، Thioflavin S، وThioflتي AVIN (أو حتى مع ميثوكسي-X04) يمكن تسمية ورقة بيتا مطوي، ولكن يتطلب تطهير واسعة مع الإيثانول لإزالة الصبغة الزائدة وهذه الإجراءات لا تتفق مع الحفاظ التركيبية. ومن شأنه أيضا أن تكون غير فعالة لأداء العلامات لAβ (وغيرها من علامات الخلوية مثل IBA1) على جميع أقسام الدماغ من المناطق ذات الاهتمام، إلا أن تسفر عن جزء صغير يحتوي على لويحات Aβ في الموقع المناسب. الأهم من ذلك، لويحات Aβ لا تزال مرئية بعد معالجة الأنسجة لEM، والسماح لتحديد دقيق للمناطق (بشكل عام ليصل إلى بضعة مليمترات مربعة) لفحص بالمجهر الإلكتروني.
Introduction
اميلويد Aβ تشكيل اللوحة هو السمة المميزة عصبية مرضية الرئيسية لمرض الزهايمر (AD). ومع ذلك أدلة متزايدة تشير إلى الأدوار المهمة للنظام المناعي في 1،2 تطور المرض. على وجه الخصوص، أنشأت بيانات جديدة من الدراسات قبل السريرية والسريرية الخلل المناعي كمحرك أساسي ومساهم في AD علم الأمراض. مع هذه النتائج، ظهرت الخلايا المناعية المركزية والطرفية الأهداف العلاجية بأنها واعدة لمدة 3 م. بروتوكول التالي يجمع بين الضوء والمجهر الإلكتروني (EM) لتوليد رؤى جديدة في العلاقة بين Aβ ترسب البلاك والتعديلات المظهرية دبقية في م. يسمح هذا البروتوكول وصفها لويحات Aβ في نماذج الفئران ميلادي استخدام في حقن الجسم الحي من صبغة الفلورسنت ميثوكسي-X04. ميثوكسي-X04 هو مشتق الكونغو الأحمر التي يمكن بسهولة عبور حاجز الدم في الدماغ لدخول حمة الدماغ وربط صحائف β-مطوي مع ارتفاعffinity. منذ صبغ فلوري، يمكن استخدامه في الجسم الحي الكشف عن Aβ وحة ترسب مع اثنين من الفوتون المجهري 4. مرة واحدة متجهة إلى Aβ، ميثوكسي-X04 لا فصل أو إعادة توزيع بعيدا من لويحات، وأنه يحتفظ مضان على مر الزمن. يدار بشكل عام محيطيا للسماح للتصوير غير الغازية للديناميات الدماغ 5. يبقى مضان أيضا بعد تثبيت ألدهيد، والسماح لتحليل المتلازم بعد الوفاة، بما في ذلك التحقيق في وفاة الخلايا العصبية في المنطقة المجاورة لويحات Aβ 6.
يأخذ هذا البروتوكول الاستفادة من خصائص ميثوكسي-X04 لتحديد أقسام الدماغ من APP SWE / PS1A 246E الفئران (APP-PS1، coexpressing طفرة مزدوجة في APP الجينات Lys670Asn / Met671Leu، والإنسان presenilin PS1-A264E البديل) 7 الذي يحمل Aβ لويحات في مناطق معينة من الفائدة (CA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-moleculare) قبل إلى ما قبل تضمين المناعية ضد علامة دبقية المتأينة ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (IBA1) لتصور أجسام الخلايا الدبقية والعمليات مع EM. أعطيت الفئران حقن داخل الصفاق من حل ميثوكسي-X04، 24 ساعة قبل تثبيت الدماغ من خلال نضح transcardial. ويتم الحصول على أقسام الدماغ الاكليلية باستخدام vibratome. يتم فحص الأجزاء التي تحتوي على CA1 الحصين تحت المجهر الفلورسنت لوجود لويحات Aβ في المشععة لطبقات والجوبية-moleculare. المناعية لIBA1، ثم يتم إجراء رباعي أكسيد الأوزميوم بعد التثبيت، والبلاستيك الراتنج التضمين على أقسام الدماغ المحدد. في نهاية هذا البروتوكول، وأقسام يمكن أرشفة دون مزيد من التدهور التركيبية، وعلى استعداد لباجتزاء سامسونج وفحص التركيبية. الأهم من ذلك، لويحات لا تزال فلوري بعد المناعية مع الأجسام المضادة مختلفة، على سبيل المثال IBA1 كما هو الحال في هذا البروتوكول. فإنها تصبح أكثر قتامة رهان neuropil من المحيط التالية رباعي أكسيد الأوزميوم بعد التثبيت، بشكل مستقل عن ميثوكسي-X04 تلطيخ، مما يساعد على تحديد دقيق للمناطق الفائدة، بشكل عام ليصل إلى بضعة مليمترات مربعة، لفحصها بالمجهر الإلكتروني النافذ.
ويوفر هذا النهج مترابط وسيلة فعالة لتحديد أقسام الدماغ محددة لفحص على مستوى التركيبية. وهذا مفيد بشكل خاص عند دراسة علم الأمراض الميلادي في وقت مبكر، في مناطق محددة في الدماغ أو الطبقات التي قد تحتوي سوى عدد قليل من لويحات Aβ، موجودة في جزء صغير فقط من أقسام الأنسجة. خلال هذه الأوقات خاصة، فإنه سيكون غير فعال لاستخدام المناعية لAβ (ووضع العلامات مزدوج للعلامات الخلوية الأخرى مثل IBA1) على عدة أقسام الدماغ ببساطة أن تسفر عن جزء صغير يحتوي على لويحات Aβ في الموقع المناسب. وبالإضافة إلى ذلك، حقن الفئران حية مع ميثوكسي-X04 قبل أن يضحي ومعالجة الأنسجة لا التراضيالبريد الحفاظ التركيبية. الطرق البديلة مثل تلطيخ بعد الوفاة مع الكونغو الأحمر، Thioflavin S، Thioflavin تي أو ميثوكسي-X04 على أقسام الأنسجة الثابتة تتطلب التفريق تلطيخ في الإيثانول، 11/08 الذي يسبب الضغط الاسموزي ويعطل التركيب الدقيق. الكونغو الأحمر هو أيضا مادة مسرطنة معروفة الإنسان 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشرح هذا البروتوكول نهج مترابط لاستهداف ويحات Aβ نواة كثيفة مع EM. ميثوكسي-X04 في حقن الجسم الحي يسمح اختيار السريع لأقسام الدماغ التي تحتوي على لويحات Aβ في مناطق معينة وطبقات من الفائدة، وعلى سبيل المثال CA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-moleculare. في المثال الح…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer’s disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
