Corrélative microscopie optique et électronique pour l'étude microgliales Interactions avec plaques ß-amyloïde
Summary
Cet article décrit un protocole pour la visualisation de plaques amyloïdes Aß dans les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer en utilisant méthoxy-X04, qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à la ß-plissés feuilles trouvées dans noyau dense plaques Aß sélectivement. Il permet la présélection des coupes de tissus contenant la plaque-avant immunocoloration et de traitement pour la microscopie électronique.
Abstract
Un protocole détaillé est fourni ici pour identifier les plaques amyloïdes de Aß dans des coupes de cerveau à partir des modèles de souris de la maladie d'Alzheimer avant le pré-enrobage immunocoloration (spécialement pour ionisée adaptateur molécule de liaison du calcium 1 (IBA1), une protéine de liaison du calcium exprimée par la microglie) et le traitement des tissus pour la microscopie électronique (EM). Méthoxy- X04 est un colorant fluorescent qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à des feuilles plissé ß trouvées dans les plaques de Aß noyau dense de manière sélective. L'injection des animaux avec des méthoxy-X04 avant le sacrifice et le cerveau de fixation permet de pré-criblage et le choix des coupes de cerveau contenant plaque dentaire pour un traitement ultérieur avec des manipulations consommatrices de temps. Cela est particulièrement utile lorsque l'on étudie la pathologie AD précoce au sein des régions ou des couches spécifiques du cerveau qui peuvent contenir très peu de plaques, présents dans seulement une petite fraction des sections. traitement post-mortem des coupes de tissus avec le Congo-Rouge, thioflavine S et Thioflavin T (ou même avec méthoxy-X04) peuvent étiqueter des feuilles ß plissés, mais nécessite une vaste clairière avec de l'éthanol pour éliminer l'excès de colorant et ces procédures sont incompatibles avec la préservation ultrastructural. Il serait également inefficace pour effectuer l'étiquetage pour Aß (et d'autres marqueurs cellulaires tels que IBA1) sur toutes les sections du cerveau des régions d'intérêt, seulement pour donner une petite fraction contenant des plaques Aß au bon endroit. Fait important, les plaques Aß sont encore visibles après le traitement des tissus pour EM, permettant une identification précise des zones (généralement jusqu'à quelques millimètres carrés) d'examiner avec le microscope électronique.
Introduction
Amyloïde Aß formation de plaque est la principale caractéristique neuropathologique de la maladie d'Alzheimer (MA). Cependant des preuves croissantes suggèrent des rôles importants du système immunitaire dans la progression de la maladie 1,2. En particulier, de nouvelles données provenant d'études précliniques et cliniques établies dysfonctionnement immunitaire en tant que principal moteur et contributeur à la pathologie AD. Avec ces résultats, les cellules immunitaires centrales et périphériques ont émergé comme des cibles thérapeutiques prometteuses pour AD 3. Le protocole suivant combine la lumière et microscopie électronique (EM) pour générer de nouvelles connaissances sur la relation entre Aß dépôt de plaque et les modifications phénotypiques microgliales dans AD. Ce protocole permet l'étiquetage des plaques Aß dans des modèles murins de AD à l' aide de l'injection in vivo du colorant fluorescent méthoxy-X04. Méthoxy-X04 est un dérivé du rouge Congo qui peut facilement traverser la barrière hémato-encéphalique pour entrer dans le parenchyme cérébral et lier des feuilles β-plissés à haute uneffinity. Etant donné que le colorant est fluorescent, il peut être utilisé pour la détection in vivo de Aß dépôt de plaques avec microscopie biphotonique 4. Une fois lié à Aß, méthoxy-X04 ne se dissocie pas ou redistribuer loin des plaques, et il conserve sa fluorescence au fil du temps. Il est généralement administré périphériquement pour permettre l'imagerie non invasive de la dynamique du cerveau 5. La fluorescence reste également suivant l' aldéhyde fixation, permettant des analyses corrélative post-mortem, y compris l' enquête de la mort neuronale dans le voisinage des plaques Aß 6.
Ce protocole tire profit des propriétés de méthoxy-X04 pour sélectionner des coupes de cerveau de souris APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; coexpression une double mutation au gène APP Lys670Asn / Met671Leu, et la variante de la préséniline PS1-A264E humaine) 7 qui présentent Aß plaques dans les régions d'intérêt spécifiques (hippocampe CA1, radiatum strates, et lacunosum-moleculare) Avant d'effectuer une pré-enrobage immunocoloration contre le marqueur microglial ionisé molécule adaptatrice liant le calcium 1 (IBA1) pour visualiser les organes et processus avec EM cellules microgliales. Les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de solution méthoxy-X04, 24 heures avant le cerveau fixation par perfusion transcardial. des sections coronales de cerveau sont obtenues en utilisant un vibratome. Les articles contenant le CA1 de l'hippocampe sont examinés sous un microscope à fluorescence pour la présence de plaques Aß en radiatum strates et lacunosum-moleculare. Immunocoloration pour IBA1, tétroxyde d'osmium post-fixation, et plastique enrobage de résine sont ensuite effectuées sur les sections du cerveau sélectionnées. A la fin de ce protocole, les sections peuvent être archivés sans autre dégradation ultrastructural, prêt pour ultramince tronçonnage et l'examen ultrastructural. Fait important, les plaques sont encore fluorescentes après immunocoloration avec des anticorps différents, par exemple IBA1 comme dans le présent protocole. Ils deviennent plus sombres than leur de neuropile environnant suivant tétroxyde d'osmium post-fixation, indépendamment de méthoxy-X04 coloration, ce qui permet d'identifier avec précision les régions d'intérêt, généralement jusqu'à quelques millimètres carrés, à examiner au microscope électronique à transmission.
Cette approche corrélative offre un moyen efficace pour identifier les sections spécifiques du cerveau à examiner au niveau ultrastructural. Cela est particulièrement utile lors de l'étude au début de pathologie AD, au sein des régions ou des couches spécifiques du cerveau qui ne peut contenir que quelques plaques de Aß, présents dans seulement une petite fraction des coupes de tissus. Pendant ces temps surtout, il serait inefficace d'utiliser immunocoloration Aß (et double étiquetage pour d'autres marqueurs cellulaires tels que IBA1) sur plusieurs sections du cerveau simplement pour donner une petite fraction contenant des plaques Aß au bon endroit. En outre, l'injection de souris vivantes avec méthoxy-X04 avant le sacrifice et le traitement des tissus ne fait pas compromise la préservation ultrastructural. D' autres méthodes telles que post-mortem coloration au rouge Congo, thioflavine S, thioflavine T ou méthoxy-X04 sur des coupes de tissus fixes nécessitent une différenciation de coloration dans l' éthanol, 8-11 qui provoque un stress osmotique et perturbe l'ultrastructure. Congo – Rouge est également un cancérogène humain connu 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole explique une approche corrélative pour le ciblage noyau dense plaques Aß avec EM. Méthoxv-X04 dans l' injection in vivo permet la sélection rapide des coupes de cerveau qui contiennent des plaques d' Aß à l' intérieur des régions particulières et les couches présentant un intérêt, par exemple CA1 de l' hippocampe, radiatum strates et lacunosum-moleculare. Dans le présent exemple, méthoxy-X04 pré-sélection a été combiné avec pré-enrobage immunocoloration …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
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