גומל אור מיקרוסקופי אלקטרונים ללמוד microglial אינטראקציות עם הפלאק β-עמילואיד
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול המאפשר הדמיה פלאק Aβ עמילואיד בעכברי מודל למחלת אלצהיימר באמצעות methoxy-X04, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. זה מאפשר הקרנת טרום סעיפים רקמה המכילה פלאק לפני immunostaining ועיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים.
Abstract
פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לזהות פלאק Aβ עמילואיד חלקים במוח ממודלי עכבר מחלת אלצהיימר לפני immunostaining טרום הטבעה (במיוחד עבור מולקולת מתאם מחייב סידן מיונן 1 (IBA1), חלבון מחייב סידן שהביע microglia) ועיבוד רקמה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). Methoxy-X04 הוא צבע פלואורסצנטי כי חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. הזרקה של החיות עם methoxy-X04 שקדם להקרבת קיבעון במוח מאפשר הקרנת טרום וגיוס כוח החלקים במוח המכיל פלאק לעיבוד נוסף עם מניפולציות זמן רב. זה מועיל במיוחד כאשר לומדים פתולוגיה לספירה מוקדם באיזורים מסויימים במוח או שכבות שעשויות להכיל הפלאק מעט מאוד, נוכח רק חלק קטן של חלקים. עיבוד פוסט מורטם של סעיפים רקמה עם האדום קונגו, Thioflavin S, ו ThioflT יבין (או אפילו עם methoxy-X04) יכול לתייג יריעות β-קפלים, אבל דורשת סליקה נרחבת עם אתנול להסיר עודפי צבע והנהלים אלה אינם עולים בקנה אחד עם שימור ultrastructural. זה גם יהיה לא יעיל לבצע תיוג עבור Aβ (ו סמנים תאיים אחרים כגון IBA1) על כל החלקים במוח מן האזורים של עניין, רק כדי להניב חלק קטן המכיל לוחות Aβ במיקום הנכון. חשוב לציין, הפלאק Aβ עדיין גלויים לאחר עיבוד רקמות עבור EM, המאפשר זיהוי מדויק של אזורים (בדרך כלל עד כמה מרובע מילימטרים) לבחון עם מיקרוסקופ אלקטרונים.
Introduction
היווצרות הפלאק עמילואיד Aβ היא סימן ההיכר נוירו העיקרי של מחלת אלצהיימר (AD). עם זאת ראיה נוספת להשערה מציעה תפקידים חשובים של המערכת החיסונית 1,2 התקדמות מחלה. בפרט, נתונים חדשים ממחקרים פרה-קליניים וקליניים הוקמו תפקוד לקוי חיסון כנהג ראשי תורם לפתולוגיה לספירה. עם ממצאים אלו, תאי מערכת חיסון מרכזיים והיקפיים צמחו מטרות טיפוליות מבטיחות ובאשר לספירה 3. הפרוטוקול הבא משלב מיקרוסקופ אור אלקטרונים (EM) כדי לייצר תובנה חדשות אודות הקשר בין בתצהיר פלאק Aβ לבין שינויי פנוטיפי microglial של מחלת אלצהיימר. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של הפלאק Aβ במודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר באמצעות הזרקת vivo של צבע פלואורסצנטי-X04 methoxy. Methoxy-X04 הוא נגזרת האדום קונגו שיכולים בקלות לחצות את המחסום שבין הדם למוח להיכנס parenchyma המוח לאגד יריעות β-קפלים עם גבוהffinity. מאז לצבוע הוא פלורסנט, ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי in vivo של בתצהיר פלאק Aβ עם שני הפוטונים מיקרוסקופיה 4. לאחר כבול Aβ, methoxy-X04 לא לנתק או להפיץ מחדש הרחק הפלאק, והוא שומר הקרינה לאורך זמן. זה מנוהל בדרך כלל שולי כדי לאפשר הדמיה לא פולשנית של דינמיקת מוח 5. הקרינה גם נשארת הבאה קיבעון אלדהיד, המאפשר שלאחר מוות גומל מנתח, לרבות חקירת מותו העצבי באזור הפלאק Aβ 6.
פרוטוקול זה מנצל את המאפיינים של methoxy-X04 כדי לבחור חלקים במוח מעכברים APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; coexpressing מוטציה כפולה הגן APP Lys670Asn / Met671Leu, וגרסא PS1-A264E presenilin האדם) 7 כי התערוכה Aβ הפלאק באזורים ספציפיים של עניין (ההיפוקמפוס CA1, radiatum שכבות, ו-moleculare lacunosumלפני) טרום הטבעת immunostaining נגד מולקולת מתאם מחייב סידן מיונן סמן microglial 1 (IBA1) לדמיין גופי תהליכים בתא microglial עם EM. העכברים מקבלים זריקה intraperitoneal של פתרון methoxy-X04, 24 שעות לפני קיבוע המוח דרך זלוף transcardial. חלקים במוח העטרה מתקבלים באמצעות vibratome. סעיפים המכילים את CA1 בהיפוקמפוס מוקרנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הנוכחות של פלאק Aβ ב radiatum שכבות-moleculare lacunosum. Immunostaining עבור IBA1, שלאחר קיבוע tetroxide אוסמיום, והטבעת שרף פלסטיק מבוצעים אז על החלקים במוח שנבחרו. בסוף פרוטוקול זה, ניתן לזהות קטעים לארכיון ללא השפלה ultrastructural נוספת, מוכן חתך ultrathin ובדיקה ultrastructural. חשוב לציין, את הפלאק עדיין הם פלורסנט לאחר immunostaining עם נוגדנים שונים, למשל IBA1 כמו בפרוטוקול הנוכחי. הם הופכים t כהההאן neuropil הסובבת אותם הבאה tetroxide אוסמיום קיבוע פוסט, ללא תלות מכתים methoxy-X04, אשר מסייע לזהות אזורים של עניין במדויק, למטה, בדרך כלל, כמה מילימטרים רבועים, להיבדק עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
גישה גומלת זו מציעה דרך יעילה לזהות חלקים במוח ספציפיים כדי לבחון ברמת ultrastructural. זה מועיל במיוחד כאשר לומדים פתולוגיה לספירה מוקדם, באיזורים מסויימים במוח או שכבות שעשויות להכיל רק כמה הפלאק Aβ, נוכח רק חלק קטן של קטעי רקמה. בזמנים אלה במיוחד, זה יהיה לא יעיל להשתמש immunostaining עבור Aβ (וסימון כפול עבור סמנים תאיים אחרים כגון IBA1) על חלקים במוח כמה פשוט להניב חלק קטן המכיל לוחות Aβ במיקום הנכון. בנוסף, הזרקה של עכברים חיים עם methoxy-X04 שקדמו להקרבה ועיבוד רקמה לא compromisדואר שימור ultrastructural. שיטות חלופיות כגון מכתים שלאחר מוות עם קונגו אדום, Thioflavin S, Thioflavin T או methoxy-X04 על סעיפי רקמות קבועים דורשות בידול מכתים באתנול, 8-11 אשר גורם ללחץ האוסמוטי ומשבש את ultrastructure. גם האדום קונגו הוא קרצינוגן אדם ידוע 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מסביר גישה המצטרפת למיקוד פלאק Aβ ליבה צפופה עם EM. Methoxy-X04 הזרקת vivo מאפשרת בחירה מהירה של חלקים במוח המכילים פלאק Aβ בתוך אזורים מסוימים ושכבות של עניין, למשל CA1 בהיפוקמפוס, radiatum שכבות, ו lacunosum-moleculare. בדוגמה הנוכחית, methoxy-X04-הקרנת טרום אוחד עם טרום הטבעה immun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer’s disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
