Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन करने के लिए β-amyloid सजीले टुकड़े के साथ सहभागिता microglial
Summary
यह लेख methoxy-X04 है, जो रक्त मस्तिष्क बाधा पार और चुनिंदा बीटा pleated घने कोर Aβ सजीले टुकड़े में पाया चादरों को बांध का उपयोग कर अल्जाइमर रोग के माउस मॉडल में amyloid सजीले टुकड़े Aβ visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। यह immunostaining और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रसंस्करण के लिए पूर्व पट्टिका युक्त ऊतक वर्गों के पूर्व स्क्रीनिंग की अनुमति देता है।
Abstract
एक विस्तृत प्रोटोकॉल से पहले अल्जाइमर रोग के माउस मॉडल से मस्तिष्क वर्गों में amyloid Aβ सजीले टुकड़े की पहचान करने के लिए यहाँ प्रदान की जाती है पूर्व embedding immunostaining और ऊतक प्रसंस्करण के लिए (विशेष रूप से आयनित कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1 (IBA1), एक कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन microglia द्वारा व्यक्त के लिए) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)। Methoxy-X04 एक फ्लोरोसेंट रंजक कि रक्त मस्तिष्क बाधा पार और चुनिंदा घने कोर Aβ सजीले टुकड़े में पाया बीटा pleated शीट को बांधता है। methoxy-X04 के साथ पशुओं के इंजेक्शन से पहले बलिदान करने के लिए और मस्तिष्क निर्धारण पूर्व स्क्रीनिंग और समय लेने वाली जोड़तोड़ के साथ आगे की प्रक्रिया के लिए पट्टिका युक्त मस्तिष्क वर्गों के चयन की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से उपयोगी है जब विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों या परतों कि बहुत कुछ सजीले टुकड़े हैं, केवल वर्गों का एक छोटा सा अंश में मौजूद हो सकती है के भीतर जल्दी ई विकृति का अध्ययन कर रहा है। कांगो लाल, Thioflavin एस, और Thiofl साथ ऊतक वर्गों का पोस्टमार्टम प्रसंस्करणAvin टी (या यहां तक कि methoxy-X04 के साथ) β-pleated शीट लेबल कर सकते हैं, लेकिन अतिरिक्त डाई दूर करने के लिए इथेनॉल के साथ व्यापक समाशोधन की आवश्यकता है और इन प्रक्रियाओं ultrastructural संरक्षण के साथ असंगत हैं। यह भी Aβ (और अन्य सेलुलर ऐसे IBA1 के रूप में मार्कर) हित के क्षेत्रों से सभी वर्गों मस्तिष्क पर लेबलिंग के लिए प्रदर्शन करने के लिए, केवल सही स्थान पर Aβ सजीले टुकड़े युक्त एक छोटा सा अंश उपज के लिए अक्षम हो जाएगा। महत्वपूर्ण बात है, Aβ सजीले टुकड़े अभी भी दिखाई दे ईएम के लिए ऊतक प्रसंस्करण के बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच करने के लिए क्षेत्रों की एक सटीक पहचान (आम तौर पर कुछ वर्ग मिलीमीटर के लिए नीचे) की अनुमति के लिए कर रहे हैं।
Introduction
Amyloid Aβ पट्टिका गठन अल्जाइमर रोग (ई) के मुख्य नयूरोपथोलोगिकल बानगी है। हालांकि बढ़ती सबूत रोग प्रगति 1,2 में प्रतिरक्षा प्रणाली की महत्वपूर्ण भूमिका चलता है। विशेष रूप से, preclinical और नैदानिक अध्ययन से नए डेटा एक मुख्य चालक और ई विकृति के लिए योगदान के रूप में प्रतिरक्षा रोग की स्थापना की। इन निष्कर्षों के साथ, मध्य और परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं ई 3 के लिए के रूप में आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों में उभरा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल Aβ पट्टिका बयान और ईस्वी में microglial प्ररूपी परिवर्तन के बीच संबंधों में नए अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने के लिए प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) को जोड़ती है। इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रंजक methoxy-X04 की विवो इंजेक्शन में उपयोग करके विज्ञापन के माउस मॉडल में Aβ सजीले टुकड़े की लेबलिंग की अनुमति देता है। Methoxy-X04 एक कांगो लाल व्युत्पन्न है कि आसानी से मस्तिष्क पैरेन्काइमा प्रवेश करने के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा पार और उच्च एक साथ β-pleated शीट बाध्य कर सकते हैffinity। चूंकि डाई फ्लोरोसेंट है, यह दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ 4 Aβ पट्टिका बयान के vivo का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक बार जब Aβ के लिए बाध्य, methoxy-X04 अलग कर देना नहीं है या सजीले टुकड़े से दूर फिर से विभाजित है, और यह समय के साथ इसके प्रतिदीप्ति बरकरार रखती है। यह आम तौर पर मस्तिष्क की गतिशीलता 5 के गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए सतही तौर पर किया जाता है। प्रतिदीप्ति भी एल्डिहाइड निर्धारण निम्न बनी हुई है, correlative पोस्टमार्टम विश्लेषण करती है, Aβ सजीले टुकड़े 6 के आसपास के क्षेत्र में neuronal मौत की जांच सहित के लिए अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल एपीपी SWE / PS1A 246E चूहों से मस्तिष्क वर्गों का चयन करने के methoxy-X04 के गुणों का लाभ लेता है (एपीपी-PS1; एपीपी जीन Lys670Asn / Met671Leu पर एक डबल उत्परिवर्तन coexpressing, और मानव presenilin PS1-A264E संस्करण) 7 कि Aβ का प्रदर्शन हित के विशिष्ट क्षेत्रों (हिप्पोकैम्पस सीए 1, तबके radiatum, और lacunosum-moleculare में सजीले टुकड़े) पूर्व एम्बेड करने microglial मार्कर आयनित कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1 (IBA1 के खिलाफ immunostaining) microglial सेल निकायों और ईएम के साथ प्रक्रियाओं कल्पना करने के लिए पहले। चूहों transcardial छिड़काव के माध्यम से methoxy-X04 समाधान, 24 घंटा मस्तिष्क निर्धारण करने से पहले की intraperitoneal इंजेक्शन दिया जाता है। राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों एक vibratome का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं। हिप्पोकैम्पस सीए 1 युक्त धारा तबके radiatum और lacunosum-moleculare में Aβ सजीले टुकड़े की उपस्थिति के लिए एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत जांच कर रहे हैं। IBA1 के लिए Immunostaining, आज़मियम tetroxide पोस्ट-निर्धारण, और प्लास्टिक राल एम्बेडिंग तब चयनित मस्तिष्क वर्गों पर प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के अंत में, वर्गों, आगे ultrastructural गिरावट के बिना संग्रहीत किया जा सकता Ultrathin सेक्शनिंग और ultrastructural परीक्षा के लिए तैयार है। महत्वपूर्ण बात है, सजीले टुकड़े अभी भी मौजूद प्रोटोकॉल के रूप में, अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ immunostaining उदाहरण के लिए IBA1 के बाद फ्लोरोसेंट रहे हैं। वे गहरे रंग की टी बननेहान आज़मियम tetroxide पोस्ट-निर्धारण के बाद उनके आसपास के neuropil, methoxy-X04 धुंधला है, जो सही, कुछ वर्ग मिलीमीटर के हित के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए, आम तौर पर नीचे में मदद करता है की स्वतंत्र रूप से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच की जाए।
इस correlative दृष्टिकोण ultrastructural स्तर पर जांच करने के लिए विशिष्ट मस्तिष्क वर्गों की पहचान करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है। यह विशेष रूप से उपयोगी है जब जल्दी ई पैथोलॉजी, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों या परतों के भीतर है कि केवल कुछ Aβ सजीले टुकड़े हैं, केवल ऊतक वर्गों का एक छोटा सा अंश में मौजूद हो सकती है अध्ययन कर रहा है। इन बार के दौरान विशेष रूप से, यह बस सही स्थान पर Aβ सजीले टुकड़े युक्त एक छोटा सा अंश उपज के लिए कई मस्तिष्क वर्गों पर (जैसे IBA1 के रूप में अन्य सेलुलर मार्करों के लिए और दोहरी लेबलिंग) Aβ के लिए immunostaining का उपयोग करने के लिए अक्षम हो जाएगा। इसके अलावा, methoxy-X04 के साथ लाइव चूहों के इंजेक्शन बलिदान करने के लिए और ऊतक प्रसंस्करण नहीं करता compromis से पहलेई ultrastructural संरक्षण। इस तरह तय ऊतक वर्गों पर कांगो लाल, Thioflavin एस, Thioflavin टी या methoxy-X04 के साथ पोस्टमार्टम धुंधला रूप में वैकल्पिक तरीकों इथेनॉल में धुंधला भेदभाव, 8-11, जो आसमाटिक तनाव का कारण बनता है और फैटी बाधित की आवश्यकता होती है। कांगो लाल भी एक ज्ञात मानव कैसरजन 12 है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ईएम के साथ घने कोर Aβ सजीले टुकड़े को निशाना बनाने के लिए एक correlative दृष्टिकोण बताते हैं। विवो इंजेक्शन में methoxy-X04 मस्तिष्क वर्गों है कि विशेष क्षेत्रों के भीतर Aβ सजीले टुकड़े हैं और ब्या?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
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