βアミロイド斑とミクログリアの相互作用を研究するために相関光と電子顕微鏡
Summary
この記事では、メトキシX04、血液脳関門を通過し、選択的にβ-プリーツする高密度コアAβ斑に見られるシートを結合し使用して、アルツハイマー病のマウスモデルにおいてアミロイドAβプラークを可視化するためのプロトコルについて説明します。これは、電子顕微鏡用の免疫染色および処理の前にプラークを含む組織切片の事前スクリーニングを可能にします。
Abstract
詳細なプロトコールは、前にアルツハイマー病のマウスモデルから脳切片におけるアミロイドAβプラークを識別するために、ここで提供される事前埋め込む免疫染色をし、組織処理のために（具体的には、イオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1）、ミクログリアによって発現されるカルシウム結合タンパク質について）電子顕微鏡（EM）。メトキシX04は、血液脳関門を通過し、選択的にβ-プリーツする高密度コアAβ斑に見られるシートを結合する蛍光色素です。メトキシX04を有する動物の注射前屠殺し、脳を固定が事前スクリーニングおよび時間のかかる操作で、さらなる処理のためにプラークを含有する脳切片の選択を可能にします。セクションのごく一部のみに存在する非常に少数のプラークを含有することができる特定の脳領域または層内の早期AD病理を研究するときに特に便利です。コンゴーレッド、チオフラビンS、およびThiofl有する組織切片の死後処理AVIN（あるいはメトキシ-X04との）Tはβプリーツシートにラベルを付けますが、過剰な染料を除去するためにエタノールとの広範な決済を必要とし、これらの手順は、超微細構造の保存と互換性がないことができます。また、唯一の右の場所でAβ斑を含むごく一部を得るために、関心領域からすべての脳切片上で、Aβのためのラベリング（およびそのようなIBA1などの他の細胞マーカー）を実行するのは非効率的であろう。重要なことは、Aβ斑は、電子顕微鏡で検査すること（一般的にダウンして数平方ミリメートル）の領域の正確な同定を可能にする、EMのための組織処理後も表示されます。
Introduction
アミロイドAβプラークの形成は、アルツハイマー病（AD）の主要な神経病理学的特徴です。しかし、増加する証拠は、疾患の進行の1,2における免疫系の重要な役割を示唆しています。具体的には、前臨床および臨床研究からの新しいデータは、AD病理にメインドライバや寄稿などの免疫不全を確立しました。これらの知見により、中枢および末梢免疫細胞は、AD 3のための有望な治療標的を浮上しています。以下のプロトコルは、Aβプラーク沈着およびADにおけるミクログリアの表現型の変化との関係に新たな洞察を生成するために、光と電子顕微鏡（EM）を組み合わせました。このプロトコルは、蛍光色素メトキシX04の生体内注入に使用して、ADのマウスモデルにおけるAβプラークの標識化を可能にします。メトキシX04は簡単に脳実質に入り、高いAとβプリーツシートを結合するために、血液脳関門を通過することができますコンゴーレッド誘導体でありますffinity。色素は蛍光性であるので、二光子顕微鏡4でAβプラーク沈着のin vivo検出のために使用することができます。一度Aβに結合した、メトキシX04は、解離またはプラークから離れて再配布、それは時間をかけて、その蛍光を保持しません。一般に脳ダイナミクス5の非侵襲的イメージングを可能にするために末梢投与されます。蛍光はまた、Aβ斑6の近傍におけるニューロン死の調査を含む、相関死後分析を可能にする、アルデヒド固定を以下のまま。
Aβを示す7;（APP遺伝子Lys670Asn / Met671Leuで二重変異を共発現し、ヒトプレセニリンPS1-A264E変異APP-PS1）このプロトコルは、APP SWE / PS1A 246eをマウスからの脳切片を選択するために、メトキシX04の性質を利用しています関心の特定の領域（海馬CA1、地層radiatum、およびlacunosum-moleculareでプラーク）ミクログリア細胞体とEMとのプロセスを可視化するために）ミクログリアマーカーイオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1に対する免疫染色を埋め込み事前に先立っ。マウスをtranscardial灌流を介して前脳を固定しメトキシX04溶液の腹腔内注射、24時間を与えられています。冠状脳切片をビブラトームを用いて得られます。海馬CA1を含むセクションでは、地層radiatumとlacunosum-moleculareにおけるAβ斑の存在を蛍光顕微鏡下でスクリーニングされます。 IBA1の免疫染色、四酸化オスミウム後固定し、プラスチック樹脂の埋め込みは、選択された脳切片上で実行されます。このプロトコルの終わりには、セクションでは、超薄切片と超微細構造検査のために準備ができて、さらに超微細構造劣化なしにアーカイブすることができます。重要なことは、プラークがまだ存在プロトコルのようにインスタンスIBA1のために、異なる抗体で免疫染色した後に蛍光性です。彼らはトン暗くなりますハン四酸化オスミウム後固定後、その周囲の神経網は、独立して正確に、数平方ミリメートルの概して下、関心領域を識別するのに役立つメトキシX04染色の透過型電子顕微鏡で観察することができます。
この相関アプローチは、超微細構造レベルで検討するために、特定の脳切片を識別するための効率的な方法を提供しています。早期AD病理を研究する場合にのみ、組織切片のごく一部のみに存在するいくつかのAβ斑を含むことができる特定の脳領域または層内に、特に有用です。特に、これらの時間の間に、単に右の場所でAβ斑を含むごく一部を得るために、いくつかの脳切片上で（例えばIBA1などの他の細胞マーカーおよび二重標識）Aβのための免疫染色を使用するのは非効率的であろう。また、メトキシX04と生きたマウスの注射屠殺前と組織処理はないコンプロミを行います超微細構造の保存を電子。このような固定された組織切片上のコンゴーレッド、チオフラビンS、チオフラビンTまたはメトキシX04と、死後染色などの代替の方法は、浸透圧ストレスの原因となり、超微細構造を破壊エタノール、8-11で染色分化を必要とします。コンゴーレッドはまた、既知のヒト発がん性物質12です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、EMと高密度コアAβ斑を標的とするための相関手法を説明しています。メトキシX04 in vivoでの注入は、例えば海馬CA1、地層radiatum、およびlacunosum-moleculareのために、関心の特定の領域と層内のAβ斑が含まれている脳切片の迅速な選択を可能にします。本実施例では、メトキシX04事前スクリーニングは、ミクログリアの表現型は、高密度コアAβ斑の存在下での超微細構造?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
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