상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는
Summary
이 문서는 혈액 – 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 – 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다.
Abstract
상세한 프로토콜은 이전에 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 섹션 아밀로이드 Aβ 플라크를 식별하기 위해 여기에서 제공되는 미리 매립 면역 및 조직 처리 (구체적으로는 이온화 된 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1), 미세 아교 세포에 의해 발현되는 칼슘 결합 단백질) 전자 현미경 (EM). 메 톡시 X04은 고밀도 코어 Aβ 플라크에서 발견 된 β-주름 시트에 바인딩 선택적으로 혈액 – 뇌 장벽을 통과하고 형광 염료입니다. 메 톡시 X04과 동물의 주입 전에 희생 뇌 고정 미리 선별하고 시간 소모적 인 조작으로 추가 처리를 위해 플라크 함유 뇌 구간 선택을 허용한다. 섹션의 작은 분획에 존재하는 거의 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 콩고 레드, Thioflavin S, 및 Thiofl와 조직 섹션의 사후 처리AVIN의 T (또는 메 톡시 X04과)는 β-주름 시트 레이블을하지만, 여분의 염료를 제거하기 위해 에탄올 광범위한 청산이 필요하며 이러한 절차는 미세 보존과 호환되지 않습니다 수 있습니다. 또한 단지 올바른 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 부분을 산출하기 위해, Aβ (및 IBA1 같은 다른 세포 마커) 관심있는 지역의 모든 뇌 부분에 대한 표시를 수행하는 비효율적 인 것입니다. 중요한 것은, Aβ 플라크는 전자 현미경으로 검사 할 영역의 정확한 식별 (일반적으로 몇 평방 밀리미터에 이르기까지)을 허용, EM을위한 조직 처리 후에도 볼 수 있습니다.
Introduction
아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크 형성은 알츠하이머 병 (AD)의 주요 신경 병리학 적 특징이다. 그러나 증거가 증가 질병 진행 1,2-에서 면역계의 중요한 역할을 시사한다. 특히, 전임상 및 임상 시험의 새로운 데이터는 AD 병리에 대한 기본 드라이버와 기여 면역 기능 장애를 설립했다. 이러한 연구 결과를 통해, 중추 및 말초 면역 세포는 AD 3으로 유망한 치료 목표를 등장했습니다. 다음 프로토콜은 아밀로이드 베타 플라크 증착 및 AD에서 소교 표현형 변화 사이의 관계에 대한 새로운 통찰력을 생성하는 빛과 전자 현미경 (EM)을 결합한다. 이 프로토콜은 형광 염료 메 톡시 X04의 생체 내 주입에 사용 AD의 마우스 모델에서 Aβ 플라크의 표시를 할 수 있습니다. 메 톡시 X04 쉽게 뇌 실질을 입력 혈액 – 뇌 장벽을 가로 질러 높은 β-와 주름진 시트를 결합 할 수있는 콩고 레드 유도체ffinity. 형광 염료이기 때문에, 두 개의 광자 현미경 4 Aβ 플라크 침착의 생체 내 검출을 위해 사용될 수있다. 일단 Aβ에 결합, 메 톡시 X04은 해리 또는 플라크에서 멀리 재배포, 그것은 시간이 지남에 따라 그 형광을 유지하지 않습니다. 일반적으로 뇌 역학 (5)의 비 침습성 영상화를 허용하는 주변으로 투여된다. 형광도 상관 사후는 Aβ 플라크 (6) 부근의 신경 세포의 죽음에 대한 조사를 포함하여, 분석을 허용 알데히드 고정 다음 남아있다.
Aβ을 나타내는 7 (APP 유전자 Lys670Asn / Met671Leu에서 이중 돌연변이를 coexpressing, 인간의 프레 PS1-A264E 변형 APP-PS1)이 프로토콜은 APP SWE / PS1A 246E 마우스에서 뇌 섹션을 선택 메 톡시 X04의 특성을 활용 특정 관심 영역 (해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에 플라크) 소교 세포 기관 및 EM과 프로세스를 시각화)가 소교 마커 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 1 (IBA1에 대한 면역 염색을 임베딩 사전하기 전에. 생쥐는 transcardial 관류를 통해 24 시간 이전에 뇌 고정에 메 톡시 X04 솔루션의 복강 내 주사 주어집니다. 코로나 뇌 섹션은 vibratome를 사용하여 얻을 수있다. 해마 CA1을 포함하는 섹션은 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에서 Aβ 플라크의 존재에 대한 형광 현미경으로 상영된다. IBA1 면역 염색, 산화 오스뮴 후 고정하고, 플라스틱 수지 매립는 선택된 뇌 구역에서 수행된다. 이 프로토콜의 끝에서, 섹션은 초박 절편 및 미세 시험에 대한 준비가 더 미세 저하없이 보관할 수 있습니다. 중요한 것은, 플라크는 여전히 본 프로토콜로 인스턴스 IBA1를 들어, 다른 항체와 면역 염색 후 형광등된다. 그들은 어두운 t이 될한 산화 오스뮴 후 고정 다음 그 주변 neuropil는 독립적으로 정확하게 몇 평방 밀리미터 일반적으로 아래의 관심 영역을 식별하는 데 도움이 메 톡시 X04 염색의 투과형 전자 현미경으로 검사한다.
이 상호 접근은 미세 수준에서 조사하는 뇌의 특정 부분을 식별 할 수있는 효율적인 방법을 제공한다. 단지 조직 절편의 작은 분획에 존재하는 약간의 Aβ 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 특히,이 시간 동안, 단순히 적절한 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 분획을 수득 몇몇 뇌 부분에 (예 IBA1 다른 세포 마커 및 이중 라벨링) Aβ에 대한 면역 염색을 사용하는 것이 비효율적 일 수있다. 메 톡시 X04 라이브 마우스 또한, 사출 희생 및 조직 처리 compromis을하지 않습니다하기 전에미세 구조 보존 전자. 이러한 고정 된 조직 섹션에 콩고 레드, Thioflavin S, Thioflavin T 또는 메 톡시 X04와 사후 염색 등의 다른 방법은 에탄올 염색 차별화, 삼투 스트레스의 원인과 미세 구조를 방해 8-11을 필요로한다. 콩고 레드는 알려진 발암 물질 (12)이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 EM과 고밀도 코어 Aβ 플라크를 대상에 대한 상호 접근 방법을 설명합니다. 생체 내 주입에 톡시 – X04은 예를 들어, 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare을 Aβ의 특정 지역 내 플라크와 관심의 층을 포함하는 뇌 부분을 신속하게 선택할 수 있습니다. 본 예에서, 메 톡시 X04 사전 심사는 소교 표현형은 고밀도 코어 Aβ 플라크의 존재 하에서 미세 수준에서 시냅스와 상호 작용하…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
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