Samsvar Lys og elektronmikroskopi for å studere microglial Interaksjoner med beta-amyloid plakk
Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for visualisering av amyloid Ap-plakk i Alzheimers sykdom musemodeller ved bruk av metoksy-X04, som krysser blod-hjerne-barrieren og selektivt bindes til p-foldede ark som finnes i tett kjerne Ap-plakk. Den lar pre-screening av plakk holdig vev seksjoner før farging og behandling for elektronmikroskopi.
Abstract
En detaljert protokoll er gitt her for å identifisere amyloid Ap-plakk i hjernen seksjoner av Alzheimers sykdom musemodeller før pre-innstøping immunofarging (spesielt for ionisert kalsium-bindende adapter molekyl 1 (IBA1), et kalsiumbindende protein uttrykt av mikroglia) og behandling vev elektronmikroskopi (EM). Metoksy-X04 er et fluorescerende fargestoff som krysser blod-hjerne-barrieren og selektivt binder til P-plissert ark som finnes i tett kjerne Ap-plakk. Injeksjon av dyrene med metoksy-X04 før ofre og hjernen fiksering kan pre-screening og valg av plakk holdige hjernen seksjoner for videre behandling med tidkrevende manipulasjoner. Dette er spesielt nyttig når man vil studere tidlig AD patologi innenfor bestemte områder av hjernen eller lag som kan inneholde svært få plakk, til stede i bare en liten brøkdel av seksjonene. Post-mortem prosessering av vevssnitt med Congo Red, Thioflavin S, og Thioflavin T (eller med metoksy-X04) kan merke p-foldede ark, men krever omfattende rydding med etanol for å fjerne overflødig fargestoff og disse prosedyrene er uforenlig med ultra bevaring. Det ville også være ineffektivt å utføre merking for Ap (og andre cellulære markører så som IBA1) på alle hjerne seksjoner fra de regioner av interesse, bare for å gi en liten fraksjon inneholdende Ap-plakk på riktig sted. Viktigere, Ap-plakk er fremdeles synlige etter vev behandling for EM, slik at for en nøyaktig identifikasjon av områdene (vanligvis ned til noen få kvadratmillimeter) for å undersøke med elektronmikroskop.
Introduction
Amyloid Ap plakkdannelse er hovednevropatologiske kjennetegn på Alzheimers sykdom (AD). Men økende bevis antyder viktige roller i immunsystemet i sykdomsprogresjon 1,2. Særlig nye data fra prekliniske og kliniske studier etablert immun dysfunksjon som en hoveddriver og bidragsyter til AD patologi. Med disse funnene, har sentrale og perifere immunceller dukket opp som lovende terapeutiske mål for AD tre. Følgende protokoll kombinerer lys og elektronmikroskopi (EM) for å generere ny innsikt i forholdet mellom Ap avleiring og mikrogliaceller fenotypiske endringer i AD. Denne protokollen tillater merking av Ap-plaketter i musemodeller av AD ved hjelp av in vivo injeksjon av fluorescerende fargestoff metoksy-X04. Metoksy-X04 er et Congo Red derivat som lett kan krysse blod-hjerne barrieren for å gå inn i hjernen parenchyma og binder β-plisserte ark med høyffinity. Siden fargestoff er fluoriserende, kan det bli brukt for in vivo deteksjon av Ap-avleiring med to-foton mikroskopi 4. Når bundet til Ap, betyr metoksy-X04 ikke distansere eller redistribuere unna plakk, og den beholder sin fluorescens over tid. Det er generelt administreres perifert for å gi rom for ikke-invasiv avbildning av hjernen dynamikk 5. Fluorescens forblir også følgende aldehyd fiksering, noe som åpner for samsvarende post-mortem analyser, inkludert undersøkelse av neuronal død i nærheten av Ap-plakk 6.
Denne protokollen tar nytte av egenskapene til metoksy-X04 for å velge hjerne seksjoner fra APP SWE / PS1A 246E mus (APP-PS1, coexpressing en dobbel mutasjon ved APP-genet Lys670Asn / Met671Leu, og menneskelig presenilin PS1-A264E variant) 7 som utviser Ap plakk i bestemte områder av interesse (hippocampus CA1, strata radiatum og lacunosum-moleculare) Før pre-embedding farging mot microglial markør ionisert kalsium-bindende adapter molekyl 1 (IBA1) for å visualisere mikrogliaceller celle organer og prosesser med EM. Musene fikk en intraperitoneal injeksjon av metoksy-X04-løsning, 24 timer før fiksering hjernen gjennom transcardial perfusjon. Koronale hjernen seksjoner oppnås ved hjelp av en vibratome. Seksjoner som inneholder hippocampus CA1 er skjermet under et fluorescerende mikroskop for tilstedeværelse av Ap-plakk i strata radiatum og lacunosum-moleculare. Farging for IBA1 er osmiumtetroksyd post-fiksering, og plast harpiks innebygging deretter utføres på de valgte hjernen seksjoner. På slutten av denne protokollen, kan delene bli arkivert uten videre ultrastructural degradering, klar for ultratynne seksjonering og ultrastructural eksamen. Viktigere er plaketter fortsatt fluorescerende etter farging med forskjellige antistoffer, for eksempel IBA1 som i denne protokollen. De blir mørkere tHan deres omkringliggende neuropil følgende osmiumtetroksyd post-fiksering, uavhengig av metoksy-X04-farging, noe som bidrar til nøyaktig identifisere regioner av interesse, vanligvis ned til noen få kvadratmillimeter, som skal undersøkes med transmisjonselektronmikroskop.
Dette samsvarende tilnærmingen gir en effektiv måte å identifisere spesifikke hjerne seksjoner for å undersøke på ultra nivå. Dette er spesielt nyttig når man vil studere tidlig AD patologi, innenfor bestemte områder av hjernen eller lag som bare kan inneholde noen Ap-plaketter, som finnes i bare en liten brøkdel av vevssnitt. I disse tider spesielt, vil det være ineffektivt å bruke immunofarging for Ap (og dobbel merking for andre cellulære markører så som IBA1) ved flere hjerneseksjoner ganske enkelt for å gi en liten fraksjon inneholdende Ap-plakk på riktig sted. I tillegg injeksjon av levende mus med metoksy-X04 før ofre og vev behandling ikke compromise den ultra bevaring. Alternative metoder som post-mortem farging med Congo Red, Thioflavin S, Thioflavin T eller metoksy-X04 på faste seksjoner vev krever farging differensiering i etanol, 8-11 som fører osmotisk stress og forstyrrer ultrastructure. Congo Red er også et kjent karsinogen for mennesker 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen forklarer en samsvarende tilnærming for målretting tett kjerne Ap-plaketter med EM. Metoksy-X04 in vivo injeksjon tillater raske utvalg av hjerne seksjoner som inneholder Ap-plakk i bestemte regioner og lag av interesse, for eksempel hippocampus CA1, strata radiatum, og lacunosum-moleculare. I det foreliggende eksempel ble metoksy-X04 pre-screening kombinert med forhånds innstøping farging for IBA1 å studere hvordan ulike mikrogliaceller fenotyper samvirke med synapser på ultra nivå i n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer’s disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
