Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung Microglial Wechselwirkungen mit β-Amyloid-Plaques
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll Amyloid-Aß-Plaques bei Alzheimer-Krankheit Mausmodellen mit methoxy-X04 für die Visualisierung, die die Blut-Hirn-Schranke durchquert und bindet selektiv an ß-plissierten in dichten Kern Aß-Plaques gefunden Blätter. Es ermöglicht Vorabsiebung von Plaque-enthaltenden Gewebeschnitten vor Immunofärbung und Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie.
Abstract
Ein detailliertes Protokoll ist vorgesehen, um Amyloid-Aß-Plaques in Hirnschnitten von Alzheimer-Krankheit Mausmodellen vor pre-Einbettungs Immunofärbung (speziell für ionisiertes Calcium bindenden Adaptermolekül 1 (Iba1), einem Calcium-Bindungsprotein exprimiert durch Mikroglia) und Gewebeverarbeitung identifizieren Elektronenmikroskopie (EM). Methoxy-X04 ist ein fluoreszierender Farbstoff, der die Blut-Hirn-Schranke durchquert und bindet selektiv an ß-plissiert gefunden Blätter in dichten Kern Aß-Plaques. Injektion der Tiere mit methoxy-X04 vor der Tötung und Gehirn Fixierung ermöglicht Vorabsiebung und Auswahl der Plaque-enthaltenden Gehirnschnitte für die Weiterverarbeitung mit zeitaufwendige Manipulationen. Dies ist besonders hilfreich, wenn sie früh AD Pathologie in spezifischen Hirnregionen oder Schichten studieren, die nur sehr wenige Plaques enthalten kann, in nur einem kleinen Teil der Abschnitte. Post-mortem-Verarbeitung von Gewebeschnitten mit Kongo-Rot, Thioflavin S und Thioflavin T (oder sogar mit Methoxy-X04) können β-Faltblättern beschriften, erfordert jedoch umfangreiche Clearing mit Ethanol überschüssige Farbe zu entfernen und diese Verfahren sind nicht kompatibel mit ultra Erhaltung. Es wäre auch ineffizient sein Kennzeichnung Aß auszuführen (und andere Zellmarker wie Iba1) auf allen Gehirnschnitte aus den Regionen von Interesse, nur eine kleine Fraktion, die Aß-Plaques an der richtigen Stelle zu ergeben. Wichtig ist, dass Aß-Plaques noch sichtbar nach Gewebeverarbeitung für EM, für eine genaue Identifizierung der Bereiche, so dass (in der Regel bis auf wenige Quadratmillimeter) mit dem Elektronenmikroskop zu untersuchen.
Introduction
Amyloid Aß Plaquebildung ist die Hauptneuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD). Allerdings zunehmende Hinweise darauf , eine wichtige Rolle des Immunsystems in den Krankheitsverlauf 1,2. Insbesondere werden neue Daten aus präklinischen und klinischen Studien etabliert Immundysfunktion als Haupttreiber und Mitarbeiter AD Pathologie. Mit diesen Erkenntnissen zentralen und peripheren Immunzellen haben als vielversprechende therapeutische Ziele für AD 3 entstanden. Das folgende Protokoll verbindet Licht- und Elektronenmikroskopie (EM) neue Einblicke in die Beziehung zwischen Aß Plaqueablagerung und Mikroglia phänotypische Veränderungen in AD zu erzeugen. Dieses Protokoll ermöglicht die Markierung von Aß – Plaques in Mausmodellen von AD in vivo Injektion des Fluoreszenzfarbstoffs unter Verwendung methoxy-X04. Methoxy-X04 ist ein Kongo-Rot-Derivat, das leicht die Blut-Hirn-Schranke überwinden können das Hirnparenchym zu betreten und zu binden β-Faltblättern mit hoherffinity. Da der Farbstoff fluoreszierend ist, kann es für die in vivo Detektion von Aß Plaqueablagerung mit Zwei-Photonen – Mikroskopie 4 verwendet werden. Sobald an Aß gebunden, Methoxy-X04 nicht trennen oder neu verteilen weg von Plaques, und es behält seine Fluoreszenz über die Zeit. Es wird im allgemeinen 5 peripher zu ermöglichen , für die nichtinvasive Bildgebung von Hirndynamik verabreicht. Die Fluoreszenz bleibt auch folgende Aldehyd Fixierung, so dass für Korrelat post-mortem – Analysen, einschließlich der Untersuchung von neuronalen Tod in der Nähe von Aß – Plaques 6.
Dieses Protokoll nutzt die Eigenschaften von Methoxy-X04 an Hirnschnitten von APP SWE / PS1A 246e Mäuse wählen (APP-PS1; Koexpression eine doppelte Mutation an APP – Gen Lys670Asn / Met671Leu und menschliche Presenilin PS1-A264E Variante) 7 , die Aß aufweisen Plaques in bestimmten Regionen von Interesse (Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare) Vor Immunfärbung gegen die Mikroglia-Marker ionisiertem Calcium-bindenden Adaptermolekül 1 (Iba1 vorab Einbettung) Mikroglia-Zellkörper und Prozesse mit EM zu visualisieren. Die Mäuse werden intraperitoneal Injektion von methoxy-X04-Lösung, 24 Stunden vor der Fixierung durch Hirn transcardial Perfusion gegeben. Koronar Gehirnschnitte werden mit einem Vibratom erhalten. Abschnitte des Hippocampus CA1 enthalten, werden unter einem Fluoreszenzmikroskop auf die Anwesenheit von Aß-Plaques in Schichten radiatum und lacunosum-moleculare gescreent. Immunofärbung für Iba1, Osmiumtetroxid post-Fixierung und Kunststoffharzeinbettung werden dann an den ausgewählten Gehirnschnitten durchgeführt. Am Ende dieses Protokolls können die Abschnitte ohne weitere ultrastrukturelle Abbau archiviert werden, bereit für die Ultradünnschnitt und ultrastrukturelle Untersuchung. Wichtig ist, dass die Plaques noch glimmenden mit verschiedenen Antikörpern nach immunostaining zum Beispiel Iba1 wie im vorliegenden Protokoll. Sie werden dunkler than deren umgebenden Neuropil folgenden Osmiumtetroxid post-Fixierung unabhängig methoxy-X04-Färbung, die die Regionen von Interesse, in der Regel auf wenige Quadratmillimeter genau zu identifizieren hilft, mit dem Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht werden.
Das Korrelat Ansatz bietet eine effiziente Möglichkeit, spezifische Gehirnschnitte zu identifizieren, die auf der ultrastruktureller Ebene zu untersuchen. Dies ist besonders hilfreich, wenn sie früh AD Pathologie, in spezifischen Hirnregionen oder Schichten zu studieren, die nur wenige Aß-Plaques, die in nur einem kleinen Bruchteil von Gewebeschnitten enthalten. Während dieser Zeiten besonders wäre es ineffizient sein Immunofärbung zu verwenden, um A & bgr; (und Dual Kennzeichnung für andere zelluläre Marker wie Iba1) auf mehreren Hirnschnitten lediglich eine kleine Fraktion, die Aß-Plaques an der richtigen Stelle zu ergeben. Darüber hinaus kann die Injektion von lebenden Mäusen mit Methoxy-X04 vor der Tötung und Gewebeverarbeitung nicht compromise die Ultrastrukturerhaltung. Alternative Methoden wie Post-mortem – Färbung mit Kongo – Rot, Thioflavin S, Thioflavin T oder Methoxy-X04 auf Gewebeschnitten erfordern Färbung Differenzierung in Ethanol, 8-11 , die osmotischen Stress verursacht und stört die Ultrastruktur. Kongo – Rot ist auch ein bekanntes menschliches Karzinogen 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll erklärt ein Korrelat Ansatz für dichten Kern Aß-Plaques mit EM-Targeting. Methoxy-X04 in vivo – Injektion ermöglicht eine schnelle Auswahl von Hirnschnitten , die Aß – Plaques enthalten in bestimmten Regionen und Schichten von Interesse, zum Beispiel den Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare. Im vorliegenden Beispiel Methoxy-X04 Pre-Screening wurde mit kombinierten Pre-Einbettung immunostaining für Iba1 zu untersuchen, wie verschiedene Mikroglia-Phänotypen mit Syna…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
Referências
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