Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

Summary

Examinou-se a concepção e desenvolvimento de um ensaio colorimétrico de nanopartículas de ouro-aptâmero para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. Além disso, uma aplicação colorimétrico-dispositivo inteligente (APP) foi validado e armazenamento a longo prazo do ensaio foi estabelecido para utilização no campo.

Abstract

Examinou-se a concepção e desenvolvimento de uma nanopartícula aptâmero-ouro (AUNP) ensaio colorimétrico para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. ensaios de cor com base alvo seletivo AUNP foram desenvolvidos em laboratório de prova de conceito controladas. No entanto, estes sistemas não têm sido exercida a um ponto de falha para determinar a sua utilização prática para além de configurações de laboratório. Este trabalho descreve uma abordagem genérica para projetar, desenvolver e solucionar problemas de um ensaio colorimétrico aptâmero-AUNP para pequenos analitos moléculas e utilizando o ensaio para as configurações in-the-campo. O ensaio é vantajosa porque aptâmeros adsorvidas passivar as superfícies de nanopartículas e fornecer um meio para reduzir e eliminar respostas falsas positivas para analitos não-alvo. A transição para este sistema usos práticos necessário definir não só o prazo de validade do ensaio aptâmero-AUNP, mas que fixa os métodos e procedimentos que se estende para o capabil armazenamento a longo prazodades. Além disso, uma das preocupações reconhecidos com leitura colorimétrica é a sobrecarga dos analistas para identificar com precisão as mudanças muitas vezes sutis na cor. Para diminuir a responsabilidade sobre analistas no campo, um protocolo de análise de cor foi projetado para desempenhar as funções de identificação de cores sem a necessidade de executar esta tarefa em equipamentos de laboratório grau. O método para criar e testar o protocolo de análise de dados é descrita. No entanto, para compreender e influenciar a concepção de ensaios de aptâmeros adsorvidas, as interacções associadas com o aptâmero, alvo, e AuNPs requerem um estudo mais aprofundado. O conhecimento adquirido pode levar a alfaiataria aptâmeros para melhorar a funcionalidade.

Introduction

Colorimetria é uma das técnicas mais antigas utilizados em química analítica. Para esta técnica, uma determinação qualitativa ou quantitativa do analito é feita com base na produção de um composto colorido ^1. Tipicamente, os ensaios de cor utilizam reagentes que experimentam uma mudança de cor na presença de espécies de analito, o que resulta numa mudança de cor observável ou detectável no espectro de luz visível. Colorimetria foi usado na detecção de alvos que variam a partir de átomos, iões e moléculas pequenas a moléculas biológicas complexas tais como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos, proteínas e ^2-4. Para as duas últimas décadas, os nanomateriais revolucionaram o campo de ensaios de detecção, em particular com ensaios baseados cor ^5-6. Combinando as propriedades químicas e físicas únicas dos nanomateriais com um elemento de reconhecimento selectivo alvo, tais como anticorpos, aptâmeros oligonucleótido ou aptâmeros de péptidos, tem levado ao ressurgimento in o design e desenvolvimento de ensaios de detecção colorimétricos ^7.

nanoparticulas metálicas possuem uma propriedade de mudança de cor dependente do tamanho demonstrado, que tem sido explorado na concepção de numerosos ensaios colorimétricos. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são de particular interesse devido a uma mudança de cor vermelho-para-azul distinta, quando a solução dispersa de partículas é induzida a agregar ^8, tipicamente através da adição precisa de sal. A capacidade para controlar a transição da disperso (vermelho) ao (azul) estados agregados levou à criação de sensores colorimétricos para iónico, pequena molecular, péptido, proteína, e alvos celulares ^2-4,9. Muitos destes sensores empregar aptâmeros como o motivo de reconhecimento do alvo.

Os aptâmeros são ADN ou moléculas de ácido ribonucleico (ARN) seleccionado a partir de um conjunto aleatório de 10 ¹² -10 ¹⁵ sequências diferentes ^10-11. O processo de seleção identifica alvo reelementos de cognição com afinidades de ligação no regime de baixa nanomolar, ea evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é o processo mais comumente conhecido ^12-13. Vantagens de aptâmeros com base de oligonucleótidos para aplicações de detecção incluem a facilidade de síntese, modificação química controlável, e a estabilidade química ^14-15.

Uma abordagem para a criação de um ensaio colorimétrico combina nanomateriais com elementos de reconhecimento, consiste em combinar estas duas espécies através da adsorção física de moléculas de ADN-aptâmero para superfícies AUNP. Através de ligação ao alvo-aptâmero, o aptâmero experimenta uma mudança estrutural ^16-18 que altera a interacção do aptâmero com a superfície de AUNP, o que leva a uma resposta de vermelho para azul indutível cor ¹⁹ com a adição de sal. Esta característica surpreendente de AuNPs fornece um mecanismo de resposta colorimétrica observáveis ​​para os dispositivos baseados em aptâmeros que podem ser utilizados para deassinar ensaios colorimétricos para diferentes analitos.

ensaios de cor projetada usando não covalentes, aptâmeros de ADN fisicamente adsorvido em superfícies AUNP tem o estigma de ser uma plataforma de sensor fraco devido a problemas com a robustez, uma propensão para o fracasso fora do ambiente controladas de laboratório, bem como a falta de informação disponível para uso em prática configurações. No entanto, o ensaio colorimétrico baseado aptâmero-AUNP era de interesse por causa da simplicidade de funcionamento e resposta de cor observável. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a concepção, desenvolvimento, operação, redução da superfície relacionada resposta falso positivo, e armazenamento de longo prazo de DNA-AUNP ensaios colorimétricos baseados usando a cocaína como substância a analisar representativa. Além disso, propusemos este adsorvida aptâmero abordagem de ensaio (Figura 1) como sendo vantajosa devido à simplicidade e facilidade de uso que resultou em menos etapas do que a abordagem convencional para estes aptâmero-AUNP assays. Para este ensaio, o aptâmero foi adicionado em primeiro lugar para as AuNPs, que foram deixadas para adsorver à superfície por um período de tempo prolongado. Uma vantagem adicional desta abordagem foi a redução de resposta a moléculas de analito não alvo relacionados com interacções de superfície AUNP. No entanto, a redução da resposta falso positivo foi em detrimento da sensibilidade do ensaio. Portanto um equilíbrio entre a proteção da superfície e acessibilidade analito é necessário para manter a função adequado do ensaio. Além disso, um grande defeito de analisar ensaios de cores através de outros meios que não com a instrumentação é que os resultados são muitas vezes subjetivo e aberto à interpretação do analista-to-analista, particularmente quando se tenta diferenciar diferenças sutis de cor. Por outro lado, há uma série de problemas com tornando instrumentação laboratorial utilizável fora do laboratório, tais como disponibilidade de energia, praticidade com portabilidade, etc. Neste trabalho, um protocolo de análise de cor foi desenvolvido para more portabilidade e para eliminar algumas das conjecturas comumente associado com a interpretação ensaio baseado cor ^20-21. Em comparação com abordagens anteriores, esse esforço se esforçado para empurrar estes ensaios para os seus limites para aplicações além de configurações de laboratório.

Protocol

1. Síntese via Citrato de Redução de Nanopartículas de Ouro (AUNP) e Caracterização Limpar um balão de Erlenmeyer (500 ml) e grande barra de agitação com 5 ml de ácido nítrico concentrado e 15 ml de ácido clorídrico concentrado na capa de segurança química. Molhar toda a superfície do balão com a lavagem com ácido, lavar o recipiente com água livre de nuclease, e permitir que o balão para secar. Adiciona-se 100 ml de cloreto de ouro 1 mM (III); usar uma folha d…

Representative Results

O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e investigar a estabilidade e robustez do apt�ero com base ensaios colorimétricos AUNP para uso no campo. Como destaque na publicação anterior, duas estratégias distintas para criar o ensaio foram investigados 7. Os ensaios foram denominado o Aptamer Ensaio Livre eo adsorvida Aptamer de Ensaio. O ensaio foi adsorvida Aptâmero mais atraente para os efeitos de um ensaio de detecção fieldable (Figura 1)…

Discussion

Ao longo da última década, os ensaios colorimétricos à base de nanopartículas têm sido desenvolvidos para a detecção de alvos incluem pequenas moléculas, ADN, proteínas, células e ^2-4. Os ensaios que utilizam ADN aptâmeros com nanopartículas têm vindo a ganhar interesse. Tipicamente, estes ensaios colorimétricos são realizadas por mistura do ADN-aptâmero com moléculas de analito seguida pela adição de AuNPs ^9-10. No entanto, estes ensaios têm sido utilizados em demonstrações …

Materials

Gold(III) chloride hydrate	Sigma	254169	99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma	W302600-1KG-K	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy	Bio-TEK	HT	Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized	Amresco	J848	Any sterilized brand will work
Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate	Fisher	430767	Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer	Varian	Cary 300	Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fluka	63068	≥98% any brand will work
DNA	IDT	Custom	DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride	ACROS	AC20731-1000	99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared
Hydrochloric Acid	Fisher	A144S-500	36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride	Lipomed	COC-156-HC-1LM	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid	Fisher	A509-SK212	65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade	Sigma	S5150-1L	Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758-25 mL	≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride	Lipomed	COC-205-HC-1LM	We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL	VWR	10011-722	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol