Um modelo de mouse Retinal isquemia-reperfusão Através elevação da pressão intra-ocular

Summary

Este artigo descreve um processo para induzir a lesão de isquemia-reperfusão da retina pela pressão intra-ocular elevada em ratos. lesão de isquemia-reperfusão da retina pela pressão intra-ocular elevada serve para modelar patologias humanas caracterizadas por oxigénio e entrega de nutrientes comprometida na retina, permitindo aos investigadores para examinar os mecanismos celulares e potenciais tratamentos para doenças humanas da unidade neurovascular da retina.

Abstract

Retinal isquemia-reperfusão (I / R) é um processo patofisiológico contribuir para os danos celulares em várias condições oculares, incluindo o glaucoma, retinopatia diabética, e oclusões vasculares retinianas. modelos de roedores de lesão de I / R estão fornecendo insights significativos em mecanismos e estratégias de tratamento para o homem I / lesão R, especialmente no que diz respeito a danos neurodegenerativa na unidade neurovascular da retina. Apresentado aqui é um protocolo para a indução de lesões retinianas I / R em ratos através da elevação da pressão intra-ocular (PIO). Neste protocolo, a câmara anterior ocular é canulada com uma agulha, por onde corre o gotejamento de um reservatório de solução salina elevada. Usando este gotejamento para elevar a PIO acima da pressão arterial sistólica, um praticante de pára temporariamente o fluxo sangüíneo da retina interna (isquemia). Quando a circulação é reposta (reperfusão) por remoção da cânula, o dano celular grave resulta, em última instância, resulta na neurodegeneração da retina. garanhão recentes demonstrar inflamação, da permeabilidade vascular, e degeneração capilar como elementos adicionais desse modelo. Em comparação com metodologias I / R retina alternativas, como a ligadura arterial da retina, retinal I / lesão R por PIO elevada oferece vantagens na sua especificidade anatómica, tractability experimental, e acessibilidade técnica, apresentando-se como uma ferramenta valiosa para examinar patogênese neuronal e terapia em a unidade neurovascular da retina.

Introduction

Retinal isquemia-reperfusão (I / R) caracteriza muitas patologias da retina humana, incluindo o glaucoma, retinopatia diabética, e oclusões vasculares retinianas ^1. Na retina I / R, redução do fluxo sanguíneo (isquemia) na vasculatura retiniana cria um estado de hipersensibilidade da retina ao oxigénio e outros nutrientes, precipitando oxidativo grave e dano inflamatório quando a circulação é, subsequentemente, reposta (reperfusão) ^2. A retina neural parece particularmente vulnerável a estas mudanças, a neurodegeneração da retina sendo talvez a característica mais saliente do dano induzido R I /. Apresentado aqui é um protocolo para a modelagem de lesão de I / R retinal no mouse. Esta técnica permite aos pesquisadores para examinar possíveis mecanismos e estratégias de tratamento para doenças humanas da unidade neurovascular da retina.

Foi pioneira em 1952 por cirurgiões que procuram compreender as consequências neurodegenerativas de anemia cirúrgica ^3, rodent retinal I / R pela pressão intra-ocular elevada (PIO) foi restabelecida em 1991 com a finalidade de padronizar endpoints neurodegenerativas após lesão isquêmica ^4. Usando o gotejamento de um reservatório de solução salina para elevar a PIO acima da pressão arterial sistólica, estes estudos demonstraram que a canulação ocular pressurizado foi suficiente para suspender a circulação da retina e desse modo iniciar a degeneração neuronal. Esforços mais recentes usando retina I / R por PIO elevada começaram a elaborar os mecanismos subjacentes I / neurodegeneração da retina induzida por R ^5-12. Vários grupos têm relatado alterações patológicas adicionais, incluindo a inflamação ^13,14, permeabilidade vascular ^15,16, e degeneração capilar ^14,17. Tomados em conjunto, estes estudos estabeleceram lesão da retina de I / R de PIO elevada como um modelo de doença retiniana neurovascular um modo mais geral.

Caracterizar os mecanismos de lesão de I / R é essencial para o estudo de VAdoença scular. Lesão da retina de I / R de PIO elevada é um dos diversos modelos de lesão induzida por hipoxia, incluindo lesões de I / R em ¹⁸ de pulmão, coração, cérebro ^{19 20 21,} fígado, rim e intestino ^{22, 23.} Estes modelos têm sido fundamental no avanço da nossa compreensão da doença vascular e seus remédios clínicos. Ao estender a investigação de processos I / R para tecidos oculares, I da retina / lesões R por PIO elevada ajuda a pintar um quadro mais abrangente destas condições relacionadas.

Correspondente em estreita colaboração com as condições clínicas neurodegenerativas na retina, I da retina / lesões R por PIO elevada apresenta uma ferramenta valiosa para os pesquisadores interessados ​​em explorar patogênese isquêmico. O protocolo aqui descrito é alvo, tratável, e acessível. É bem complementado por pontos de extremidade na degeneração neuronal, tais como a quantificação de neurónios da retina, a medição da espessura da retina, e R electrofisiológicoecording da retina a função do neurônio. Este modelo tem provado a sua utilidade no avanço da investigação neurovascular, e isso mostra a promessa em ganhar status como um protocolo fundamental na pesquisa da medicina visual.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Johns Hopkins. Nota: Os ratinhos utilizados durante a filmagem são ratinhos C57BL / 6 de Jackson, embora também possam ser utilizadas outras estirpes ou espécies de roedores. Ao utilizar outras estirpes ou espécies, estar ciente de que as doses de anestesia e cronograma lesão pode variar. É importante para adaptar as cond…

Representative Results

Os efeitos neurodegenerativos da retina de I / R de elevada pressão intra-ocular são geralmente avaliadas utilizando duas abordagens convencionais. NeuN imunomarcação dos núcleos neuronais revelou perda de células neuronais significativa após I / R insulto (Figura 1). Em resumo, os olhos enucleados 7 dias após I / R, foram fixadas em paraf ormaldeído, marcado com o marcador da célula neuronal NeuN, e todo-montado. As imagens foram capturadas usando microscopia …

Discussion

I retina / lesões R por PIO elevada provou a sua utilidade na modelagem de danos celulares e disfunção, especialmente neurodegeneração, na unidade neurovascular da retina de roedores. Este procedimento fornece um tecido de controle robusto e é facilmente acessível em termos de sofisticação técnica. Tem-se observado neste e em outros modelos de lesão I / R que o aumento da pressão e da duração da isquemia pode aumentar a gravidade da lesão ^24. Por esta razão, alguns profissionais têm optado po…

Materials

Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1000 USP/mL
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 mL
SC-2kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/mL)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/mL)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30G1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1mL TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60mL Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X)	Invitrogen	10010-049	500 mL
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 mL
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/mL
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/mL)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/mL
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/mL
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579