Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
Cryo-scanning elektronenmicroscopie (SEM) van-freeze gebroken monsters maakt onderzoek naar biologische structuren op near native omstandigheden. We beschrijven een techniek voor het bestuderen van supramoleculaire organisatie van fotosynthetisch (thylakoid) membranen binnen bladmonsters. Dit wordt bereikt door hoge druk bevriezing van bladweefsel, vries-breken, double-layer coating en tenslotte cryo-SEM beeldvorming. Gebruik van een dubbele-bekleding werkwijze maakt het verkrijgen hoge vergroting (> 100,000X) met minimaal beam schade aan de bevroren gehydrateerd monsters en minimale effecten opladen. Met behulp van de beschreven procedures die we onderzoek gedaan naar de veranderingen in de supramoleculaire distributie van fotosysteem en lichte oogsten antenne eiwitcomplexen die plaatsvinden tijdens uitdroging van de opstanding fabriek Craterostigma pumilum in situ.
Introduction
Oxygenic fotosynthese, van oorsprong uit het oude cyanobacteriën, werd overgenomen door algen en landplanten door endosymbiotic gebeurtenissen die hebben geleid tot de ontwikkeling van de chloroplast organel. In alle hedendaagse oxygenic fototroof zijn fotosynthetische elektronen transport en het genereren van proton-motive force en het verminderen van de macht binnen afgeplatte sac-achtige blaasjes zogenaamde 'thylakoid' membranen uitgevoerd. Deze membranen huis van de eiwitcomplexen die de light-driven reacties van fotosynthese uit te voeren en een medium voor energie transductie. De thylakoïdmembranen van planten en (sommige) algen worden onderverdeeld in twee afzonderlijke morfologische domeinen: strak appressed membraan regio genaamd 'grana' en gestapelde membranen die de grana met elkaar te verbinden, de zogenaamde 'stroma lamellen "1. Diverse freeze-fractuur studies van planten en algen thylakoïdmembranen zijn uitgevoerd, te beginnen in de vroege jaren 1970. Bij bevriezing gebroken, membranenverdelen langs hun hydrofobe kern 2, genereren van een exoplasmatische vlak (EF) en een protoplasma vlak (PF), afhankelijk van de cellulaire compartiment dat helft membraan grenzen, zoals oorspronkelijk bedacht door Branton et al. . in 1975 3 Plant en algen thylakoiden hebben vier verschillende breuk gezichten: EF, efu, PF en PFU, met een 's' en 'u' aanduiding 'gestapeld' en 'gestapelde' membraan regio's, respectievelijk. Het membraan eiwitcomplexen, die niet gesplitst of gebroken, hebben de neiging met ofwel de E of P zijde van het membraan blijft. De initiële observaties dat de verschillende breukvlakken van de thylakoiden bevatten deeltjes van verschillende afmetingen en dichtheden 4, en de talrijke onderzoeken die volgde, leidde tot de identificatie en correlatie tussen de waargenomen deeltjes en het membraaneiwit complexen die de lichtreacties uitvoeren 5-13 (beoordelingen zie ook 14,15).
Freeze-fractuur experimenten van thylakoïdmembranen worden gewoonlijk uitgevoerd over de voorbereidingen van de chloroplasten of geïsoleerde thylakoïdmembranen (maar zie 16,17), met het risico van een wijziging in de structurele en / of supramoleculaire organisatie die zich kunnen voordoen tijdens de isolatie procedure. Na breuk worden replica's bereid door verdamping van platina / koolstof (Pt / C), vervolgens een dikke laag koolstof (C), en tenslotte digestie van het biologische materiaal 18. Replica's zijn gevisualiseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De traditionele freeze-fractuur-replica techniek blijft om te dienen als een belangrijk instrument voor het bestuderen van de supramoleculaire organisatie van de fotosynthetische membranen en hun aanpassing aan verschillende, bijv., Licht, condities 19-23.
In onze recente studie van de homoiochlorophyllous opstanding fabriek Craterostigma pumilum 24, we gericht op de veranderingen in de supramoleculaire organisatie o onderzoekenf thylakoïdmembranen, evenals de totale cellulaire organisatie gedurende dehydratatie en rehydratatie. Het unieke van homoiochlorophyllous opstanding soort is dat ze in staat zijn om de voorwaarden van uitdroging overleven in hun vegetatieve weefsels (bladeren), met behoud van hun fotosynthese-apparaat. Zodra water beschikbaar is, deze planten herstellen en hervatten fotosynthetische activiteit in uren tot enkele dagen 25. Voor dit onderzoek, cryo-EM scanning (SEM) beeldvorming van gevries- gebroken bladmonsters werd gecombineerd met hogedruk freezing sample cryo-immobilisatie. Deze procedures bieden een middel om de bevroren gehydrateerd biologische monsters te visualiseren in een staat dicht bij hun natieve toestand 26. Een belangrijk voordeel is dat de monsters direct na bevriezen-breuk en coating zonder verschillende stappen worden onderzocht. Dit is vooral relevant voor het onderzoek van planten op verschillende relatieve inhoud water (RWC), als hun hydratie toestand tijdens de bereiding wordt gehandhaafd. Hoeooit een belangrijke nadeel is dat bevroren gehydrateerd monsters tijdens beeldvorming kunnen lijden aan beam opleveren, met name wanneer gescand bij hoge vergrotingen, vereist voor nauwkeurige meting van de grootte van fotosynthetische complexen. Om dit te overwinnen, een methode genaamd 'double-layer coating' (DLC) 27,28 gecombineerd met specifieke cryo-SEM beeldvorming omstandigheden werden gebruikt. Deze resulteerden in monsters die zijn aanzienlijk minder beam-gevoelig en toegestaan voor de opheldering van waardevolle informatie over fotosynthetische eiwit supramoleculaire organisatie en andere cellulaire bestanddelen van de opstanding fabriek C. pumilum bij hoge vergrotingen in situ.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit document beschreven techniek maakt onderzoek gevries- gebroken membranen in de context van goed bewaarde hogedruk bevroren plantenweefsel door cryo-scanning elektronenmicroscopie. Het grote voordeel van het gebruik van deze procedures is dat de bereiding van de monsters is puur lichamelijk; geen stappen met chemische stoffen of uitdroging zijn noodzakelijk. Zo staat het bestuderen van biologische structuren op een near-native state 26,32. Het voordeel van bladweefsel is dat informatie over de totale…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Andres Kaech (Universiteit van Zurich) voor zijn nuttig advies over het scannen van elektronen microscopie beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door de Verenigde Staten en Israël binationale Agricultural Research and Development Fund (verlenen no. US-4334-10, ZR), de Israel Science Foundation (verlenen nr. 1034/12, ZR) en het Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). De elektronen microscopie studies werden uitgevoerd bij de Irving Moskowitz en Cherna Center for Nano en Bio-Nano Imaging aan het Weizmann Institute of Science.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
Referências
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Bioquímica. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Bioquímica. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
