Intra Imaging av nøytrofile Grunning Bruke IL-1B Arrangøren drevet DsRed Reporter Mus

Summary

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Abstract

Nøytrofile er de mest tallrike leukocytter i menneskets blodsirkulasjonen og er raskt rekruttert til inflammatoriske områder. Grunning er en kritisk hendelse som forbedrer phagocytic funksjonaliteten av nøytrofile. Selv om omfattende studier har avdekket eksistensen og betydningen av nøytrofile priming under infeksjoner og skader, betyr å visualisere denne prosessen in vivo har vært utilgjengelig. Protokollen gitt muliggjør kontroll av den dynamiske prosessen med nøytrofil priming i levende dyr ved å kombinere tre metoder: 1) DsRed reporter signal – som brukes som et mål for priming 2) in vivo nøytrofil merking – oppnådd ved injeksjon av fluorescens-konjugert anti-lymfocytt antigen 6G (Ly6G) monoklonalt antistoff (mAb) og 3) intra konfokal avbildning. Flere kritiske trinn er involvert i denne protokollen: oksazolon-indusert mus øret hudbetennelse, riktig sedasjon av dyr, gjentatte injeksjoner av anti-Ly6G mAb, og prevention av fokus drift under bildebehandling. Selv om noen få begrensninger er blitt observert, så som grensen for kontinuerlig avbildning tid (~ 8 timer) i en mus, og den lekkasje av fluorescein isotiocyanat-dekstran fra blodkarene i den inflammatoriske tilstand, gir denne protokollen en grunnleggende rammeverk for intravital avbildning av primet nøytrofile atferd og funksjon, som lett kan utvides til undersøkelse av andre immunceller i mus betennelse modeller.

Introduction

Nøytrofile er de mest tallrike og kortvarige leukocytter i omløp. De er raskt rekruttert til nettstedene til infeksjon eller skade, hvor de tjener som profesjonelle fagocytter gjennom utgivelsen av reaktive oksygen- og nitrogenmellom sammen med granulat som inneholder antimikrobielle peptider og proteaser ^1. Under rekruttering, er nøytrofile "primet" av ulike agenter inkludert mikrobielle produkter, chemoattractants og inflammatoriske cytokiner, noe som resulterer i vesentlig styrket phagocyte funksjonalitet ved ankomst til et område av betennelse ^to. Mekanismene for nøytrofile priming har blitt grundig studert in vitro ^3,4; har imidlertid dynamisk overvåkning av prosessen in vivo ikke vært mulig til dags dato.

Nylig har intrabilde blitt en viktig teknikk for å visualisere og kvantifisere de cellulære dynamikken i biologiske prosesser i levende organismer. Intravital bildebehandling kan utføres via vanlig ett foton eksitasjon mikroskopi (f.eks confocal) eller multiphoton mikros nærmer ^fem. Over tid har betydelige forbedringer er oppnådd i denne teknikken gir økt bildeoppløsning, forbedret bildedybde, redusert vev photodamage, og forbedret bildestabilisering ^6,7. Gitt sin unike evne til å aktivere dynamisk visualisering av cellemigrasjon og samhandling over tid har intravital mikroskopi blitt mye brukt til ulike studieretninger i immunologi ^8. Intra bildebehandling gjør immunologer å bedre forstå og kontekstualisere immunresponser både på cellulært og molekylært nivå i levende dyremodeller.

Nylige fremskritt innen transgen samt knock-in reporter mus har gitt nyttige verktøy for å overvåke de dynamiske atferd av nøytrofile i levende dyr. Lysozym M promoter-drevet forbedret grønt fluorescerende protein knock-inmus har blitt mye brukt for å karakterisere motilitet av nøytrofiler, monocytter og makrofager i løpet av forskjellige inflammatoriske prosesser, inkludert ekstravasasjon, bakteriell infeksjon, og steril betennelse ^9-15. Videre har transgene mus som uttrykker en cytoplasma fluorescens resonans energi overføring biosensor vært ansatt i å studere aktivitetene til nøytrofile ekstracellulære-regulert mitogen kinase og protein kinase A innenfor betent tarmen ^16. En murin modell med høy spesifisitet for fluorescens-ekspresjon i neutrofiler er catchup knock-in mus, som produserer Cre rekombinase, så vel som den fluorescerende protein tdTomato, som selv er koplet til ekspresjon av lymfocytt antigen 6G (Ly6G) ^17. Visualisering av Ly6G-manglende neutrofiler via denne modellen har vist at disse cellene utøver normal funksjon i en rekke sterile eller smittsomme in vivo-inflammatoriske sammenhenger. Transgene mus som uttrykker DsRed fluorescerende protein genet under kontroll av muse interleuikin-1β (IL-1β) promoter (pIL1-DsRed) er blitt anvendt for å visualisere de bevegelige atferd av IL-1-produserende celler – antas å omfatte nøytrofiler, inflammatoriske monocytter og aktiverte makrofager – voksende i betent hud ^18.

In vivo merking kan fungere som et alternativ tilnærming for å spore de cellulære og molekylære atferd av nøytrofile i betent vev. Etter intravenøs injeksjon av lave doser av fluorescensmerket anti-Gr-1 monoklonalt antistoff (mAb), rekruttering kaskade av Gr-1 ⁺ nøytrofile er visualisert i mus hudlesjoner infisert med Staphylococcus aureus ^19. In vivo administrering av konjugater som inneholder streptavidin konjugerte 705 nm kvanteprikker og biotinylert anti-Ly6G mAb spesifikt merke sirkulerende nøytrofile ^20. Videre endocytose av slike konjugater inn neutrophil vesikler tillater sporing av høyhastighets vesikkeltransport nøytrofile migrere inn i interstitium. In vivo merking med fluorescens-konjugert antistoff mot P-selektin glykoprotein ligand-en (PSGL-1), L-selectin (CD62L), inte αM (CD11b ) og chemokine (CXC motiv) reseptor 2 (CXCR2) i en TNFa-indusert inflammatorisk modellen har belyst de regulatoriske mekanismer som spiller inn under tidlig betennelse ^21. Polariserte neutrofiler rage PSGL-1-anriket uropods å samvirke med CD62L til stede på aktiverte blodplater, noe som resulterer i en omfordeling av CD11b og CXCR2, recep som driver nøytrofil migrering og initiere betennelse.

IL-1β er en av signaturen gener som er forhøyet i primet nøytrofile ^22. I pIL1-DsRed rapportør mus, DsRed fluorescens-signaler (f.eks. Aktivering av IL-1β promoter) positivt korrelerer med IL-1β mRNA-ekspresjon og IL-1β proteinproduksjon. <sup> 18 For å overvåke prosessen med nøytrofil grunning, ble en intravital mikroskopi metode utviklet omfatter induksjon av betennelse i huden med oksazolon (OX) i den pIL1-DsRed musemodell følgende in vivo merking av neutrofiler med fluorescens-konjugert anti-Ly6G mAb. Via denne modellen, er det mulig å studere oppførselen og funksjon av primede neutrofiler i dyremodeller av forskjellige sykdommer og lidelser.

Protocol

Alle dyreforsøk er utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Toledo. 1. fenotyping av pIL1-DsRed Mus MERK: Offspring er generert av avl heterozygote pIL1-DsRed mus med villtype (WT) C57BL6 mus. Tre til fire uker gamle valper regnes klar for fenotyping. Submandibular blødning av mus følger en etablert protokoll med mindre modifikasjoner 23. …

Representative Results

Screening av pIL1-DsRed mus blir utført basert på den fenotypiske DsRed fluorescens-signal som frembringes av sine perifere blodleukocytter ved hjelp av strømningscytometri. LPS-stimulering er kjent for å indusere IL-1β produksjon i myeloide celler, inkludert neutrofiler, monocytter, dendrittiske celler og 26-28. Således er isolerte leukocytter inkubert med LPS i 4 timer før strømningscytometri-analyse. Deretter blir gating innstilt for sirkulering av myeloide celler b…

Discussion

Målet med denne studien er å utvikle en teknologi for å overvåke prosessen med nøytrofile priming i levende dyr, som ennå ikke har blitt oppfylt av de tilgjengelige teknikker. For å oppnå dette målet, blir tre etablerte metoder utført: 1) induksjon av betennelse i huden i IL-1 p-promotordrevet DsRed rapportør mus som et mål for priming, 2) in vivo merking av neutrofiler med lave doser av fluorescens-konjugert anti-Ly6G mAb, og 3) intravital konfokal mikroskopi avbildning. Kombinasjonen av disse tre …

Materials

Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 Kda	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging