Intravital Imaging af neutrofil Priming Brug af IL-1-promotor-drevet dsRed Reporter Mus
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter i humant blod cirkulation og er hurtigt rekrutteret til inflammatoriske steder. Priming er en kritisk begivenhed, der forbedrer fagocytiske funktionalitet af neutrofiler. Selv omfattende undersøgelser har afsløret eksistensen og betydningen af neutrofil priming under infektion og skade, betyder visualisere denne proces in vivo har været utilgængelig. Protokollen tilvejebragt muliggør overvågning af den dynamiske proces med neutrofil priming i levende dyr ved at kombinere tre metoder: 1) DsRed reporter signal – der anvendes som et mål for priming 2) in vivo neutrofil mærkning – opnås ved injektion af fluorescens-konjugeret anti-lymfocyt antigen 6G (Ly6G) monoklonalt antistof (mAb) og 3) intravital konfokal billeddannelse. Flere kritiske trin er involveret i denne protokol: oxazolon-induceret mus øre betændelse i huden, passende sedation af dyr, gentagne injektioner af anti-Ly6G mAb, og prevention af fokus afdrift under billedbehandling. Selv om der er observeret et par begrænsninger, såsom grænsen for kontinuerlig imaging tid (~ 8 timer) i en mus og udsivning af fluoresceinisothiocyanat-dextran fra blodkar i den inflammatoriske tilstand, denne protokol giver en grundlæggende ramme for intravital billeddannelse af primet neutrofil adfærd og funktion, som let kan udvides til undersøgelse af andre immunceller i muse inflammationsmodeller.
Introduction
Neutrofiler er de mest udbredte og kortlivede leukocytter i omløb. De er hurtigt rekrutteret til de steder på infektion eller skade, hvor de tjener som professionelle fagocytter gennem frigivelse af reaktive oxygen og nitrogen mellemprodukter sammen med granulat, der indeholder antimikrobielle peptider og proteaser 1. Under deres rekruttering, er neutrofiler "primet" ved forskellige midler, herunder mikrobielle produkter, kemoattraktanter og inflammatoriske cytokiner, hvilket resulterer i markant forbedret fagocyt funktionalitet ved ankomsten til et sted for inflammation 2. Mekanismerne i neutrofile priming er blevet grundigt undersøgt in vitro 3,4; imidlertid dynamisk overvågning af processen in vivo ikke været muligt hidtil.
For nylig er intravital billeddannelse blevet en vigtig teknik til at visualisere og kvantificere de cellulære dynamik biologiske processer i levende organismer. Intravital billeddannelse kan udføres via konventionelle et-foton excitation mikroskopi (f.eks konfokal) eller multifoton mikroskopi nærmer 5. Over tid er der opnået betydelige forbedringer i denne teknik muliggør øget billedopløsning, forbedret billedbehandling dybde, nedsat væv solskader, og forbedret billedstabilisering 6,7. I betragtning af sin unikke evne til at aktivere dynamisk visualisering af cellulære migration og interaktion over tid, er intravital mikroskopi blevet grundigt anvendt til forskellige områder af undersøgelsen i immunologi 8. Intravital billedbehandling giver immunologer til bedre at forstå og kontekstualisere immunreaktioner på både det cellulære og molekylære niveau i levende dyremodeller.
Nylige fremskridt i transgene samt knock-in reporter mus har givet nyttige værktøjer til overvågning af dynamiske adfærd af neutrofiler i levende dyr. Lysozym M-promotor-drevet forstærket grønt fluorescerende protein knock-inmus udstrækning er blevet anvendt til at karakterisere motilitet af neutrofiler, monocytter og makrofager under forskellige inflammatoriske processer, herunder ekstravasation, bakteriel infektion, og sterilt inflammation 9-15. Endvidere er transgene mus, der udtrykker en cytoplasmatisk fluorescensresonansenergioverførsel biosensor blevet anvendt i at studere aktiviteter neutrofil ekstracellulær-reguleret mitogen kinase og proteinkinase A inden betændt tarm 16. En murin model med høj specificitet for fluorescens ekspression i neutrofiler er catchup knock-in-mus, som producerer Cre-rekombinase samt det fluorescerende protein tdTomato, som kobles til ekspression af lymfocyt antigen 6G (Ly6G) 17. Visualisering af Ly6G-deficiente neutrofiler via denne model har vist, at disse celler udøver normal funktionalitet i en række forskellige sterile eller infektiøse in vivo inflammatoriske sammenhænge. Transgene mus, der udtrykker DsRed fluorescerende protein genet under kontrol af muse interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) er blevet anvendt til at visualisere de motile adfærd af IL-1-producerende celler – antages at indbefatte neutrofiler, inflammatoriske monocytter og aktiverede makrofager – emerging i betændt hud 18.
In vivo mærkning kan tjene som en alternativ metode til sporing af de cellulære og molekylære adfærd af neutrofiler i betændte væv. Efter intravenøs injektion af lave doser af fluorescensmærket anti-Gr-1-monoklonalt antistof (mAb), rekruttering kaskade af Gr-1 + neutrofiler er blevet visualiseret i mus hudlæsioner inficeret med Staphylococcus aureus 19. In vivo administrering af konjugater indeholdende streptavidin- konjugeret 705 nm quantum dots og biotinyleret anti-Ly6G mAb specifikt mærke cirkulerende neutrofile 20. Endvidere endocytose af sådanne konjugater til neutrophil vesikler muliggør sporing af højhastigheds-vesikel transport i neutrofiler, der migrerer ind i interstitium. In vivo mærkning med fluorescens-konjugeret antistoffer mod P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b ) og chemokin (CXC motiv) receptor 2 (CXCR2) i en TNF-induceret inflammatorisk model har belyst de regulatoriske mekanismer på spil i den tidlige inflammation 21. Polariserede neutrofiler stikker PSGL-1-beriget uropods at interagere med CD62L til stede på aktiverede blodplader, hvilket resulterer i en omfordeling af CD11b og CXCR2, receptorer, der driver neutrofil migration og initierer inflammation.
IL-1β er en af signatur-gener, der er forhøjet hos primede neutrofiler 22. I pIL1-dsRed reporter mus, dsRed fluorescenssignaler (dvs.., Aktivering af IL-1β-promotor) positivt korrelere med IL-1β mRNA-ekspression og IL-1β proteinproduktion. <sup> 18 Sådan overvågning af neutrofil priming blev en intravital mikroskopi metode udviklet involverer induktion af hudinflammation med oxazolon (OX) i pIL1-DsRed musemodel følgende in vivo mærkning af neutrofiler med fluorescens-konjugeret anti-Ly6G mAb. Via denne model, er det muligt at studere og funktion af primede neutrofiler i dyremodeller af forskellige sygdomme og lidelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en teknologi til overvågning af processen af neutrofil priming i levende dyr, som endnu ikke er blevet opfyldt af de aktuelt tilgængelige teknik. For at nå dette mål, er tre etablerede metoder udført: 1) induktion af hudinflammation i IL-1p-promotordrevet dsRed reporter mus som et mål for priming, 2) in vivo mærkning af neutrofiler med lave doser af fluorescens-konjugeret anti-Ly6G mAb, og 3) intravital konfokal mikroskopi billeddannelse. Kombinatione…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
Referências
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
