Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter
Summary
This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.
Abstract
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea humana e são rapidamente recrutados para sítios inflamatórios. Priming é um evento crítico que aumenta a funcionalidade fagocitária dos neutrófilos. Apesar de extensos estudos têm revelado a existência e importância de priming de neutrófilos durante a infecção e lesões, os meios de visualizar este processo in vivo têm sido indisponíveis. O protocolo fornecido permite o monitoramento do processo dinâmico de neutrófilos priming em animais vivos através da combinação de três métodos: 1) sinal de repórter DsRed – usado como uma medida de priming 2) in vivo rotulagem de neutrófilos – alcançada por injecção de antigénio anti-linfócito de fluorescência conjugada 6G (Ly6G) de anticorpo monoclonal (mAb) e 3) de imagem confocal intravital. Vários passos críticos estão envolvidos neste protocolo: Rato inflamação induzida por oxazolona pele da orelha, sedação adequada de animais, injeções repetidas de Ly6G anti-mAb, e prevenção do desvio de foco durante o exame. Embora não tenham sido observadas algumas limitações, tais como o limite de tempo de imagem contínua (~ 8 horas) em um mouse e o vazamento de isotiocianato-dextrano fluoresceína a partir de vasos sanguíneos no estado inflamatório, este protocolo fornece uma estrutura fundamental para imagiologia intravital de comportamento e função de neutrófilos com iniciador, que pode ser facilmente expandido para análise de outras células do sistema imunológico em modelos de inflamação do rato.
Introduction
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases 1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são "preparada" por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação 2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos têm sido extensivamente estudada in vitro 3,4; No entanto, o controlo dinâmico do processo in vivo, não foi possível até à data.
Recentemente, tornou-se imagens intravital uma técnica importante para visualizar e quantificar a dinâmica de processos biológicos celulares em organismos vivos. IntraviTal imagem pode ser realizada por meio de microscopia de excitação de um fotão convencional (por exemplo, confocal) ou microscopia multifotônica aproxima 5. Com o tempo, melhorias substanciais foram alcançados nesta técnica que permite maior resolução de imagem, profundidade de imagem melhorada, diminuiu photodamage tecidos e melhorada 6,7 estabilização de imagem. Dada a sua capacidade única para permitir a visualização dinâmica da migração celular e interação ao longo do tempo, microscopia intravital tem sido amplamente aplicada a diversas áreas de estudo em imunologia 8. imagens intravital permite imunologistas para melhor compreender e contextualizar as respostas imunes, tanto a nível celular e molecular em modelos animais vivos.
Os recentes avanços na transgênicos, bem como knock-in ratos repórter forneceram ferramentas úteis para o monitoramento dos comportamentos dinâmicos de neutrófilos em animais vivos. Lisozima M promotor-driven proteína verde fluorescente melhorada knock-inratos têm sido amplamente utilizados para caracterizar a motilidade de neutrófilos, monócitos e macrófagos, durante vários processos inflamatórios incluindo extravasamento, infecção bacteriana, e a inflamação estéril 9-15. Além disso, os ratinhos transgénicos que expressam uma energia de ressonância de fluorescência de transferência biossensor citoplasmática foram empregues para estudar as actividades dos neutrófilos mitogénio quinase extracelular regulada e proteína quinase A dentro de intestino inflamado 16. Um modelo murino com elevada especificidade para a expressão de fluorescência em neutrófilos é a knock-in rato Catchup, que produz a recombinase Cre, bem como a proteína fluorescente tdTomato, que por sua vez está acoplado a expressão de antigénio de linfócitos 6G (Ly6G) 17. A visualização de neutrófilos Ly6G deficientes via este modelo tem demonstrado que estas células exercer funcionalidade normal numa variedade de contextos in vivo inflamatórias estéreis ou infecciosas em. camundongos transgênicos expressando o DsRed fluorescente protein gene sob o controlo do rato interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) ter sido utilizada para visualizar os comportamentos motilidade de células produtoras de IL-1 – Acredita-se que os neutrófilos, os monócitos inflamatórios, e macrófagos activados – emergente em pele inflamada 18.
In vivo rotulagem pode servir como uma abordagem alternativa para a detecção de comportamentos celulares e moleculares de neutrófilos nos tecidos inflamados. Depois de injecção intravenosa de doses baixas de anticorpo monoclonal marcado por fluorescência anti-Gr-1 (Acm), a cascata de recrutamento de Gr-1 + neutrófilos foi visualizada em lesões da pele do rato infectados com Staphylococcus aureus 19. Administração in vivo de conjugados contendo estreptavidina conjugados 705 pontos quânticos nm e mAb anti-Ly6G biotinilado rotular especificamente neutrófilos circulantes 20. Além disso, a endocitose de tais conjugados em neutrophIL vesículas permite o acompanhamento do transporte de vesículas de alta velocidade em neutrófilos que migram para o interstício. In vivo, marcação com anticorpos de fluorescência conjugada contra a P-selectina Ligando-1 Glicoproteico (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e quimioquina (motivo CXC) do receptor 2 (CXCR2) num modelo inflamatória induzida por TNFa tem elucidado os mecanismos de regulação em jogo durante a inflamação precoce 21. neutrófilos polarizados sobressair urópodos PSGL-1-enriquecida para interagir com CD62L presente em plaquetas activadas, resultando na redistribuição de CD11b e CXCR2, receptores que dirigem a migração de neutrófilos e iniciam a inflamação.
IL-1β é um dos genes de assinatura que é elevado em neutrófilos sensibilizados 22. Em ratinhos repórter pIL1-DsRed, DsRed sinais de fluorescência (isto é., A activação do promotor de IL-1β) correlacionam-se positivamente com a IL-1β expressão de ARNm e a produção de proteína IL-1β. <sup> 18 Para monitorar o processo de priming de neutrófilos, um método de microscopia intravital foi desenvolvido envolvendo a indução de inflamação da pele com oxazolona (OX) no modelo do rato pIL1-DsRed seguinte rotulagem in vivo de neutrófilos com Ly6G anti-mAb fluorescência conjugada. Através deste modelo, é possível estudar o comportamento e função de neutrófilos, preparadas em modelos animais de várias doenças e desordens.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste estudo é desenvolver uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos, que ainda não foi cumprida pelas técnicas atualmente disponíveis. Para atingir este objectivo, três metodologias estabelecidas são realizados: 1) a indução de inflamação da pele em ratinhos repórter DsRed-driven promotor de IL-1p como uma medida da escorva, 2) in vivo rotulagem dos neutrófilos com doses baixas de fluorescência-conjugado anti-Ly6G mAb, e 3) de imagem de microsc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 Kda | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
Referências
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging–deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
