جيل من الخلايا الجذعية المستحثة-المحفزة عن طريق Synoviocytes الخلايا الليفية مثل المعزولة من المفاصل من التهاب المفاصل الروماتويدي المرضى
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات البشرية من synoviocytes تشبه الخلايا الليفية المستمدة من المريض، وذلك باستخدام نظام lentiviral دون الخلايا المغذية.
Abstract
الخلايا الجسمية الناضجة يمكن عكسها إلى المحفزة تشبه الخلايا الجذعية دولة باستخدام مجموعة محددة من العوامل برمجة. لقد ولدت العديد من الدراسات التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) من مختلف أنواع الخلايا الجسدية من قبل transducing أربعة عوامل النسخ ياماناكا: Oct4، Sox2، Klf4 وج. Myc على. تبقى دراسة iPSCs في طليعة من الأبحاث البيولوجية والسريرية. على وجه الخصوص، iPSCs المريض محددة يمكن أن تستخدم كأداة رائدة لدراسة البيولوجيا المرضية المرض، منذ iPSCs يمكن أن يتسبب من الأنسجة من أي فرد. التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن، مصنفة حسب تدمير الغضروف والهيكل العظمي في مفصل. تضخم الزليلي هي واحدة من الأسباب الرئيسية أو الأعراض التي تؤدي إلى هذه النتائج في التهاب المفاصل الروماتويدي. Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي الخلايا المكونة الرئيسية في الغشاء الزليلي التصنع. FLSs في مفصل تتكاثر دون حدود، في نهاية المطاف غزو cartil المجاورةالعمر والعظام. حاليا، الغشاء الزليلي التصنع يمكن إزالتها إلا عن طريق إجراء العمليات الجراحية. يتم استخدام الغشاء الزليلي إزالة للبحث RA كمادة يعكس حالة التهاب المفصل. كما لاعبا رئيسيا في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي، FLSs يمكن استخدامها كمادة لتوليد والتحقيق في iPSCs من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي. في هذه الدراسة، استخدمنا FLSs لمريض التهاب المفاصل الروماتويدي لتوليد iPSCs. باستخدام نظام lentiviral، اكتشفنا أن FLSs يمكن أن تولد RA المريض محددة التوجيهية. وiPSCs الناتجة عن FLSs يمكن مواصلة استخدامها كأداة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المفاصل الروماتويدي في المستقبل.
Introduction
الخلايا الجذعية المحفزة هي منصة الجيل القادم في مختلف المجالات السريرية والبيولوجية. وهي أداة الواعدة التي يمكن استخدامها في النمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاج الطبي على التجدد. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بشكل رئيسي إلى دراسة وفهم الخلايا المحفزة. ومع ذلك، معزولة عن تدمير الكيسة الإنسان، وترتبط hESCs مع العديد من المخاوف الأخلاقية. في عام 2007، والدكتور شينيا ياماناكا وفريقه عكس عملية برمجة الخلية وتطوير الخلايا الجذعية من البالغين البشري الخلايا الجسدية 1،2. وبالتالي، فخلافا hESCs، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) يمكن أن تتولد من الخلايا الجسمية الناضجة، وتجنب العقبات الأخلاقية.
عادة، يتم إنشاؤها iPSCs قبل تسليم أربع جينات الخارجية: Oct4، Sox2، Klf4، وج. Myc على. يتم تسليم هذه العوامل ياماناكا أصلا باستخدام أنظمة lentiviral وفيروسات. وقد استمدت هذه iPSCs الأولى من الماوس جسدية جملتعلمي اللغة اإلنكليزية 3. بعد ذلك، تم تطبيق هذه التقنية لالليفية الجلدية الإنسان 1،2. دراسات لاحقة إنشاء بنجاح iPSCs من مصادر مختلفة، مثل البول 4، والدم 5،6، الكيراتينية 7، والعديد من أنواع الخلايا الأخرى. ومع ذلك، هناك بعض الخلايا الجسدية التي لم يتم استخدامها في إعادة برمجة، وفحص إمكانيات إعادة برمجة مختلف أنواع الخلايا من أنسجة معينة في حالة المرض، لا تزال هناك حاجة.
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو المرض الذي يمكن أن يصيب جميع المفاصل ويؤدي إلى الظروف الذاتية في الأجهزة الأخرى. RA يصيب حوالي 1٪ من البالغين في العالم المتقدم. وهو مرض شائع نوعا ما، وانتشاره يزيد كل سنة 8. ومع ذلك، RA من الصعب تحديد في المراحل المبكرة وoncebone تدمير يحدث هناك أي علاج يمكن أن استرداد الضرر. وعلاوة على ذلك، نجاعة الأدوية تختلف من مريض لآخر، وأنه من الصعب التنبؤ مسعفالمعهد الوطني للإحصاء ما هو مطلوب. لذلك، هناك حاجة إلى تطوير طريقة فحص المخدرات، ومطلوب مادة الخلية التي يمكن أن تعكس ظروف RA.
Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي مشاركا نشطا الخلوي في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي 9،10. توجد FLSs في بطانة باطنة الزليلي بين الكبسولة المشتركة وتجويف، الذي يشار إليه أيضا باسم الغشاء الزليلي. من خلال دعم الهيكل المشترك وتوفير المواد الغذائية للغضروف المحيطة بها، FLSs عادة ما تلعب دورا حاسما في وظيفة مشتركة والصيانة. ومع ذلك، FLSs في الاتحاد الإقليمي لها النمط الظاهري الغازية. RA FLSs يكون النمط الظاهري للسرطان مثل، في نهاية المطاف تدمير العظام المحيطة بها من انتشار لانهائي 10. مع هذه الخاصية الفريدة، FLSs يمكن استخدامها كمادة الواعدة التي يمكن أن تعكس البيولوجيا المرضية من التهاب المفاصل الروماتويدي. ومع ذلك، ونادرا ما يتم إنتاج هذه الخلايا، والظواهر خلية يغير مثل خلايا تذهب من خلال العديد من المقاطع في في المختبر </eم> الظروف. وبالتالي، فإنه يمكن أن يكون معقدا لاستخدام RA FLSs كأداة التي يمكن أن تمثل حالة المريض.
نظريا، يمكن RA iPSCs المستمدة من المريض (RA-iPSCs) تصبح أداة مثالية لفحص المخدرات وإجراء مزيد من البحوث. iPSCs ولدت لديها قدرة التجديد الذاتي ويمكن الحفاظ على وتوسعت في المختبر. مع تعدد القدرات، وهذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة في ناضجة خلية غضروفية وخلية عظمية الأنساب، التي يمكن أن تسهم المواد خلية للبحوث محددة في RA وغيرها من الأمراض المرتبطة العظام 11.
في هذه الدراسة، ونحن لشرح كيفية عزل وتوسيع FLSs من الغشاء الزليلي ازالتها جراحيا، وكيفية توليد RA-iPSCs من FLSs باستخدام lentiviruses التي تحتوي على عوامل ياماناكا.
Protocol
Representative Results
Discussion
قبل اكتشاف iPSCs والعلماء تستخدم أساسا المجالس الاقتصادية والاجتماعية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية والأنساب الخلية الأخرى من خلال التمايز. ومع ذلك، المجالس الاقتصادية والاجتماعية تنشأ من الكتلة الداخلية من الكيسة، وهو الجنين في مرحلة مبكرة. لعزل المجالس الاقتصا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
Referências
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
