प्रेरित pluripotent स्टेम तंतुकोशिका-तरह Synoviocytes का उपयोग कोशिकाओं की पीढ़ी रुमेटी गठिया के रोगियों के जोड़ों से पृथक
Summary
यहाँ हम रोगी व्युत्पन्न fibroblast-तरह synoviocytes से मानव प्रेरित-स्टेम कोशिकाओं को पैदा करने, फीडर कोशिकाओं के बिना एक lentiviral प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Abstract
परिपक्व दैहिक कोशिकाओं reprogramming कारकों में से एक परिभाषित सेट का उपयोग कर एक स्टेम सेल की तरह राज्य में उलट हो सकता है। Oct4, Sox2, Klf4 और सी Myc: कई अध्ययनों से चार यामानाका प्रतिलेखन कारक transducing द्वारा विभिन्न दैहिक प्रकार की कोशिकाओं से प्रेरित-pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) उत्पन्न किया है। IPSCs का अध्ययन जैविक और नैदानिक अनुसंधान की धार पर बनी हुई है। विशेष रूप से, रोगी विशेष IPSCs के बाद से IPSCs किसी भी व्यक्ति के ऊतकों से प्रेरित किया जा सकता है, रोग pathobiology के अध्ययन के लिए एक अग्रणी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। संधिशोथ (आरए) एक जीर्ण सूजन की बीमारी, कार्टिलेज और संयुक्त में हड्डियों के ढांचे के विनाश के द्वारा वर्गीकृत है। श्लेष हाइपरप्लासिया प्रमुख कारण या लक्षण है कि आरए में इन परिणामों के लिए नेतृत्व में से एक है। Fibroblast-तरह Synoviocytes (FLSs) hyperplastic synovium में मुख्य घटक कोशिकाओं रहे हैं। संयुक्त में FLSs limitlessly पैदा करना, अंत में आसन्न cartil पर हमलाउम्र और हड्डी। वर्तमान में, hyperplastic synovium केवल एक शल्य प्रक्रिया द्वारा हटाया जा सकता है। हटा synovium एक सामग्री है कि संयुक्त के भड़काऊ हालत को दर्शाता है के रूप में आरए अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है। आरए के रोगजनन में एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में, FLSs पैदा करते हैं और आरए रोगियों के IPSCs जांच करने के लिए एक सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम IPSCs उत्पन्न करने के लिए एक आरए रोगी की FLSs इस्तेमाल किया। एक lentiviral प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमें पता चला कि FLSs आरए रोगी विशेष IPSC उत्पन्न कर सकते हैं। FLSs से उत्पन्न IPSCs आगे भविष्य में आरए के pathophysiology अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
स्टेम कोशिकाओं विभिन्न नैदानिक और जैविक क्षेत्रों में अगली पीढ़ी के मंच हैं। वे एक होनहार उपकरण है कि रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा उपचार में इस्तेमाल किया जा सकता है। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) मुख्य रूप से अध्ययन करने और pluripotent कोशिकाओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया। बहरहाल, मानव ब्लास्टोसिस्ट के विनाश से अलग, hESCs कई नैतिक चिंताओं के साथ जुड़े रहे हैं। 2007 में, डा शिन्या यामानाका और उनकी टीम सेल प्रोग्रामिंग प्रक्रिया उलट और मानव वयस्क दैहिक कोशिकाओं 1,2 से स्टेम कोशिकाओं को विकसित किया है। इसलिए, hESCs के विपरीत, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) परिपक्व दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है, नैतिक बाधाओं से परहेज।
Oct4, Sox2, Klf4, और सी Myc: आमतौर पर, IPSCs चार बहिर्जात जीन का वितरण द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। इन कारकों यामानाका मूल lentiviral और रेट्रोवायरल सिस्टम का उपयोग कर दिया जाता है। पहले IPSCs से माउस दैहिक ग प्राप्त किए गएएल 3। बाद में, तकनीक मानव त्वचीय fibroblasts 1,2 करने के लिए लागू किया गया था। बाद के अध्ययन सफलतापूर्वक ऐसी मूत्र 4, रक्त 5,6 के रूप में विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न IPSCs, keratinocytes 7, और कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं। हालांकि, वहाँ कुछ दैहिक कोशिकाओं है कि reprogramming में इस्तेमाल नहीं किया गया है, और इस बीमारी से राज्य में विशिष्ट ऊतकों से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के reprogramming क्षमताओं की स्क्रीनिंग कर रहे हैं, अभी भी आवश्यक है।
संधिशोथ (आरए) एक रोग है कि सभी जोड़ों हड़ताल और अन्य अंगों में स्व-प्रतिरक्षित की स्थिति को जन्म दे सकता है। आरए विकसित दुनिया में वयस्कों के बारे में 1% को प्रभावित करता है। यह एक नहीं बल्कि आम बीमारी है और इसकी घटना को हर साल 8 बढ़ जाती है। हालांकि, आरए प्रारंभिक अवस्था में पहचान करने के लिए कठिन है और विनाश oncebone होता है कोई इलाज है कि क्षति को ठीक कर सकता है। इसके अलावा, दवा प्रभावकारिता रोगी से रोगी से अलग है, और यह डॉक्टर की भविष्यवाणी करना मुश्किल हैine कि आवश्यक है। इसलिए, एक दवा स्क्रीनिंग पद्धति के विकास की जरूरत है, और एक सेल सामग्री है कि आरए की स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं की आवश्यकता है।
Fibroblast-तरह Synoviocytes (FLSs) आरए 9,10 के रोगजनन में एक सक्रिय सेलुलर भागीदार हैं। FLSs संयुक्त कैप्सूल और गुहा, जो भी synovium के रूप में जाना जाता है के बीच श्लेष intimal अस्तर में मौजूद हैं। संयुक्त संरचना का समर्थन और आसपास उपास्थि के लिए पोषक तत्वों प्रदान करके, FLSs आम तौर पर संयुक्त समारोह और रखरखाव करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, आरए में FLSs एक आक्रामक phenotype है। आरए FLSs अंततः अनंत प्रसार 10 से आसपास के हड्डी को नष्ट करने के लिए एक कैंसर की तरह phenotype है। इस अनूठी विशेषता के साथ, FLSs एक होनहार सामग्री है कि आरए के pathobiology प्रतिबिंबित कर सकते हैं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, इन कोशिकाओं को शायद ही कभी उत्पादित कर रहे हैं, और सेल phenotypes को बदलने के रूप में कोशिकाओं में इन विट्रो में कई मार्ग के माध्यम से जाना </eM> की स्थिति। इसलिए, यह एक उपकरण है कि मरीज की हालत प्रतिनिधित्व कर सकते हैं के रूप में आरए FLSs का उपयोग करने के लिए जटिल हो सकता है।
सैद्धांतिक रूप से, आरए रोगी व्युत्पन्न IPSCs (RA-IPSCs) दवा स्क्रीनिंग और आगे अनुसंधान के लिए एक आदर्श उपकरण बन सकता है। जनित IPSCs आत्म नवीकरण की क्षमता है और बनाए रखा और इन विट्रो में विस्तार किया जा सकता है। Pluripotency के साथ, इन कोशिकाओं को परिपक्व उपास्थिकोशिका और osteocyte प्रजातियों, जो आरए और अन्य हड्डी से संबंधित बीमारियों 11 में विशिष्ट अनुसंधान के लिए सेल सामग्री में योगदान कर सकते हैं भेदभाव किया जा सकता है।
इस अध्ययन में, हम अलग और एक शल्य चिकित्सा द्वारा हटा synovium, और कैसे से FLSs विस्तार यामानाका कारकों युक्त lentiviruses का उपयोग कर FLSs से RA-IPSCs उत्पन्न करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
IPSCs की खोज से पहले, वैज्ञानिकों मुख्य रूप से इस्तेमाल किया ESCs भेदभाव के माध्यम से स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और अन्य सेल प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए। हालांकि, ESCs एक ब्लास्टोसिस्ट, जो एक प्रारंभिक चरण भ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
Referências
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- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
