류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성
Summary
여기에서는 피더 세포없이 렌티 바이러스 시스템을 이용하여, 환자 유래의 섬유 아세포와 같은 활막에서 인간 – 유도 된 다 능성 줄기 세포를 생성하기위한 프로토콜을 기술한다.
Abstract
성숙한 체세포 프로그래밍 요소의 정의 된 집합을 사용하여 다 능성 줄기 세포와 같은 상태로 되돌릴 수있다. 인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 C-Myc와 : 많은 연구는 네 야마나카의 전사 인자를 형질 도입에 의해 다양한 체세포 유형의 유도-다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성했다. iPSCs 연구는 생물학 및 임상 연구의 최첨단에 남아있다. iPSCs 어떤 개인의 조직으로부터 유도 될 수 있기 때문에, 특히, 환자 별 iPSCs은 질병의 병리 생물학 연구 선구 도구로 사용될 수있다. 류마티스 관절염 (RA)은 관절 연골 및 뼈 구조의 파괴에 의해 분류 된 만성 염증성 질환이다. 활막 증식은 RA의 결과로 이어질 주요 원인이나 증상 중 하나입니다. 섬유 아세포 등 활막 (FLSS)가 증식 성 활막의 주성분 세포이다. 공동의 FLSS는 무제한 결국 인접 cartil 침입, 증식나이와 뼈. 현재, 과형성 활막은 수술에 의해 제거 될 수있다. 제거 된 활막은 관절의 염증 상태를 반영하는 재료로서 RA 연구에 사용된다. RA의 발병 기전에 중요한 플레이어, FLSS 생성하여 RA 환자의 iPSCs를 조사하는 재료로서 사용될 수있다. 본 연구에서는 iPSCs를 생성 RA 환자의 FLSS를 사용했다. 렌티 바이러스 시스템을 사용하여, 우리는 FLSS가 RA 환자 별 IPSC를 생성 할 수 있음을 발견했다. FLSS로부터 생성 iPSCs 더 앞으로 RA의 기전을 연구 도구로서 사용할 수있다.
Introduction
다 능성 줄기 세포는 다양한 임상과 생물 분야에서 차세대 플랫폼이다. 이들은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 회생 의학적 치료에 사용될 수있는 유망한 도구이다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)이 주로 연구 및 다 능성 세포를 이해하기 위해 사용되었다. 그러나, 인간 배반포의 파괴에 의해 분리, hESCs는 여러 윤리적 문제와 연관된다. 2007 년, 박사 신야 야마나카와 그의 팀은 셀 프로그래밍 과정을 역으로 인간 성인의 체세포 1,2에서 줄기 세포를 개발했다. 따라서 hESCs는 달리 유도 – 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)은 윤리적 장애물 회피, 성숙한 체세포에서 생성 될 수있다.
인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와 : 일반적으로, iPSCs는 네 개의 외래 유전자의 전달에 의해 생성됩니다. 이러한 야마나카 인자는 원래 렌티 바이러스 및 레트로 바이러스 시스템을 사용하여 제공됩니다. 첫 번째 iPSCs는 마우스 체세포의 C에서 파생 된ELL 학생 3. 그 후, 방법은 인간 피부 섬유 아세포 1,2- 적용 하였다. 후속 연구는 성공적 소변 -4- 피 5,6- 같은 다양한 소스로부터 생성 iPSCs 7 각질 및 기타 여러 세포 유형. 그러나 일부 체세포 프로그래밍에 사용되지 않은 세포 및 질병 상태의 특정 조직에서 다양한 세포 유형의 프로그래밍 기능 검사가 여전히 필요하다.
류마티스 관절염 (RA)는 모든 관절을 공격하고 다른 기관에서자가 면역 조건으로 이어질 수있는 질환이다. RA는 선진국에서 성인의 약 1 %에 영향을 미칩니다. 그것은 오히려 일반적인 질환과 그 발생 빈도는 매년 8 증가한다. 그러나, RA는 초기에는 파악하기 어렵다 파괴 oncebone 손상을 복구 할 수있는 치료가없는 일어난다. 또한, 약효는 환자마다 상이하고, 그 메딕을 예측하기 어렵다필요 오프라인. 따라서, 약물 스크리닝 방법의 개발이 필요하고, RA의 조건을 반영 할 수있는 셀 재료가 필요하다.
섬유 아세포와 같은 활막 (FLSS)는 RA 9,10의 발병에 적극적으로 세포의 참가자입니다. FLSS는 활막이라고 관절낭과 캐비티 사이의 활액 내막 안감에 존재한다. 조인트지지 구조 및 주변 연골에 영양분을 제공함으로써, FLSS는 일반적으로 관절 기능과 유지에 결정적인 역할을한다. 그러나, RA에서 FLSS는 침략 표현형을 가지고있다. RA FLSS 결국 무한 증식 (10)에 의해 주위의 뼈를 파괴, 암과 같은 표현형을 가지고있다. 이 독특한 특성으로 FLSS는 RA의 병리 생물학을 반영 할 수있는 유망한 재료로서 사용될 수있다. 그러나, 이들 세포는 거의 생성되지 않으며, 세포를 시험관 내에서 여러 통로를 통해 진행하면서 세포 표현형 변화 </em은> 조건. 따라서, 환자의 상태를 나타낼 수있는 도구로서 RA FLSS를 사용하여 복잡 할 수있다.
이론적으로, RA 환자에서 파생 된 iPSCs (RA-iPSCs)는 약물 검사 및 추가 연구를위한 이상적인 도구가 될 수 있습니다. 생성 iPSCs 자기 갱신 능력이 유지 및 시험 관내에서 확장 될 수있다. 능성,이 세포는 RA 및 기타 뼈 관련 질환 (11)의 특정 연구 세포 물질 기여 성숙한 연골 세포 및 골 세포 계통으로 분화 될 수있다.
본 연구에서는 분리 및 야마나카 인자를 포함하는 렌티 바이러스를 사용하여 FLSS에서 RA-iPSCs를 생성하는 수술로 제거 활액막 및 방법에서 FLSS을 확장하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSCs의 발견 전에 과학자들은 주로 차별화를 통해 줄기 세포 생물학 및 다른 세포 계통을 연구하기는 ESC를 사용했다. 그러나,는 ESC는 초기 단계의 배아 인 배반포의 내부 매스에서 유래. 는 ESC를 분리하기 위해, 배반포의 파괴를 극복하기 불가능한 윤리적 문제를 제기 불가피하다. 는 ESC가 stemness와 다 능성 특성을 갖고 있지만, 또한, 이들은 개인으로부터 수득 될 수없고, 때로는 맞춤 분석 및 질병…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
Referências
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- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
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