Generering av inducerade-pluripotenta stamceller med hjälp fibroblastliknande synoviocyter Isolerad från fogar av patienter med reumatoid artrit

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att generera humana inducerade-pluripotenta stamceller från patientgenererade fibroblastliknande synoviocyter, med användning av en lentiviral system utan matarceller.

Abstract

Mogna somatiska celler kan vändas till en pluripotenta stamceller liknande tillstånd med hjälp av en definierad uppsättning av omprogrammering faktorer. Ett flertal studier har genererat inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs) från olika somatiska celltyper genom transduktion fyra Yamanaka transkriptionsfaktorer: Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc. Studien av iPSCs kvar på framkanten av biologisk och klinisk forskning. I synnerhet, kan patientspecifika iPSCs användas som ett banbrytande verktyg för studier av sjukdoms Patobiologi, eftersom iPSCs kan induceras från vävnaden för varje individ. Reumatoid artrit (RA) är en kronisk inflammatorisk sjukdom, uppdelade efter förstörelsen av brosk och ben struktur i leden. Synovial hyperplasi är en av de viktigaste orsakerna eller symptom som leder till dessa resultat i RA. Fibroblastliknande synoviocyter (FLSs) är den viktigaste komponenten celler i hyperplastisk synovium. FLSs i fogen obegränsat prolifererar, så småningom invaderar intilliggande cartilålder och ben. För närvarande kan hyper synovium avlägsnas endast genom ett kirurgiskt ingrepp. Den borttagna synovium används för RA forskning som ett material som reflekterar det inflammatoriska tillståndet i leden. Som en stor aktör i patogenesen av RA kan FLSs användas som ett material för att generera och undersöka iPSCs av RA-patienter. I denna studie har vi använt FLSs av en RA-patient att generera iPSCs. Med användning av en lentiviral systemet, upptäckte vi att FLSs kan generera RA patientspecifik iPSC. De iPSCs genereras från FLSs kan vidare användas som ett verktyg för att studera patofysiologin för RA i framtiden.

Introduction

Pluripotenta stamceller är nästa generations plattform i olika kliniska och biologiska områdena. De är ett lovande verktyg som kan användas i sjukdomsmodellering, drug screening, och regenerativ medicinsk behandling. Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) användes främst för att studera och förstå pluripotenta celler. Men isoleras genom förstörelsen av den mänskliga blastocysten är hESCs i samband med flera etiska betänkligheter. År 2007, Dr Shinya Yamanaka och hans team omvänd cell programmeringsprocessen och utvecklat stamceller från mänskliga vuxna somatiska celler ^1,2. Därför, till skillnad från hESCs, inducerade-pluripotenta stamceller (iPSCs) kan genereras från mogna somatiska celler, som man undviker de etiska hinder.

Vanligtvis är iPSCs genereras av leverans av fyra exogena gener: Oct4, Sox2, Klf4, och c-Myc. Dessa Yamanaka faktorer ursprungligen levereras med hjälp av lentivirala och retrovirala system. De första iPSCs härleddes från mus somatisk calnar ^3. Efteråt var den teknik som tillämpas på humana dermala fibroblaster ^1,2. Senare studier framgångsrikt genererade iPSCs från olika källor, såsom urin ^4, blod ^5,6, keratinocyter ^7, och flera andra celltyper. Det finns dock några somatiska celler som inte har använts i omprogrammering och screening av omprogrammering kapacitet olika celltyper från specifika vävnader i sjukdomstillstånd, krävs fortfarande.

Reumatoid artrit (RA) är en sjukdom som kan drabba alla skarvar och leda till autoimmuna tillstånd i andra organ. RA drabbar omkring 1% av de vuxna i den utvecklade världen. Det är en ganska vanlig sjukdom och dess förekomst ökar varje år ^8. Emellertid är RA svåra att identifiera i de tidiga stadierna och oncebone förstörelse inträffar finns det ingen behandling som kan återställa skadan. Dessutom skiljer sig läkemedlets effektivitet från patient till patient, och det är svårt att förutsäga sjukvårdareine som krävs. Därför behövs utveckling av ett läkemedelsscreeningsmetod, och ett cellmaterial som kan reflektera villkoren i RA krävs.

Fibroblastliknande synoviocyter (FLSs) är en aktiv cellulär deltagare i patogenesen av RA ^9,10. FLSs finns i synovial intima foder mellan ledkapseln och hålrum, som också kallas synovium. Genom att stödja den gemensamma strukturen och ge näring till omgivande brosk, FLSs brukar spela en avgörande roll i ledfunktion och underhåll. Emellertid FLSs i RA har en invasiv fenotyp. RA FLSs har en cancer-liknande fenotyp, så småningom förstöra det omgivande benet av oändlig spridning ^10. Med denna unika egenskap kan FLSs användas som ett lovande material som kan återspegla patobiologi av RA. Ändå är dessa celler sällan produceras och cellfenotyper ändra när cellerna går igenom flera passager i in vitro </em> villkor. Därför kan det vara komplicerat att använda RA FLSs som ett verktyg som kan representera patientens tillstånd.

Teoretiskt kan RA patientgenererade iPSCs (RA-iPSCs) bli ett idealiskt verktyg för läkemedelsscreening och ytterligare forskning. Genererade iPSCs har självförnyelse förmåga och kan bibehållas och expanderas in vitro. Med pluripotens, kan dessa celler differentieras till mogna kondrocytceller och osteocyte linjer, som kan bidra cellmaterial för specifik forskning i RA och andra benrelaterade sjukdomar ^11.

I denna studie visar vi hur man isolera och expandera FLSs från en bortopererad synovium, och hur man skapar RA-iPSCs från FLSs använder lentivirus innehåller Yamanaka faktorer.

Protocol

Etik: Den här studieprotokoll godkändes av Institutional Review Board av det katolska universitetet i Korea (KC12TISI0861). 1. Synoviocyte Isolering och Expansion Synoviocyte Isolering Sterilisera två par av kirurgiska saxar och en pincett. Överföra den synoviala vävnaden till en 100 mm skål och tvätta med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1% penicillin / streptomycin. Skär av gulaktiga fettvävnad och skelettrester. Överföra det trimmade vävn…

Representative Results

I denna studie beskriver vi ett protokoll för att generera iPSCs från FLSs med hjälp av en Lentiviral systemet. Figur 1A visar en enkel schema över FLS isolering protokollet. Efter kirurgiskt avlägsnande av synovium, var vävnaden hackas i små bitar med hjälp kirurgisk sax. Kollagenas tillsattes för att isolera cellerna från klumpar av vävnad. Celler inkuberades under 14 dagar före ytterligare bearbetning. Figur 1B visar morfo…

Discussion

Innan upptäckten av iPSCs, forskare används främst ekonomiska och sociala råd att studera stamcellsbiologi och andra cellinjer genom differentiering. Emellertid ESCs härstammar från den inre massan av en blastocyst, vilken är en tidig embryo. För att isolera ekonomiska och sociala råd, är förstörelsen av blastocysten oundviklig, höja etiska frågor som är omöjliga att övervinna. Även om ekonomiska och sociala råden har stemness egenskaper och pluripotens, de kan inte komma från personer och är ibland…

Materials

100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/mL)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004