This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
क्रम में पोषक तत्वों के अस्तित्व के लिए आवश्यक प्राप्त करने के लिए, घातक ट्यूमर रोगी के रक्त प्रवाह के लिए उपयोग की आवश्यकता है। उस तक पहुँच पाने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं, रासायनिक संकेतों कि ट्यूमर को नई रक्त वाहिकाओं के विकास को प्रोत्साहित रिलीज इस प्रकार angiogenesis 2 के रूप में जाना सामान्य शारीरिक प्रक्रिया अपहरण। यह angiogenesis कि मेटास्टेसिस (यानी, अन्य अंगों में कैंसर के प्रसार) हो सकता है के माध्यम से बनाया रक्त वाहिकाओं के माध्यम से भी है। क्योंकि angiogenesis की प्रक्रिया इतनी तरह के कैंसर का इतना व्यापक विविधता की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है, यह कैंसर विरोधी चिकित्सा अनुसंधान 3 में एक आकर्षक लक्ष्य है।
एक angiogenesis यों इस्तेमाल तरीका है जब एक बाह्य मैट्रिक्स पर रखा endothelial पूर्वज सेल की नलियों फार्म की क्षमता को मापने के लिए है। क्योंकि इन ट्यूबों के गठन angiogenesis में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है, पर्यावरण की स्थिति (जैसे, उपस्थिति या किसी दिए गए सीओ की कमी का परीक्षणmpound) कि उत्तेजित या बाधित कर सकते हैं ट्यूब गठन विशिष्ट कदम है कि angiogenesis को बाधित करने का लक्ष्य रखा जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। Endothelial सेल ट्यूब गठन परख सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया 4 इन विट्रो तरीकों कि 'कोशिकाओं नलियों फार्म की क्षमता उपायों में से एक है। यह एक सरल परख, अपेक्षाकृत कुछ घटकों और एक छोटी संस्कृति अवधि 5 की आवश्यकता होती है। शायद सबसे महत्वपूर्ण बात है, तथापि, कि डेटा परख के इस प्रकार से प्राप्त quantifiable है।
ट्यूब गठन परख के उपयोग के लिए एक उदाहरण संवहनी endothelial बाह्य मैट्रिक्स बनाम वृद्धि कारक कम हो (जीएफआर) बाह्य मैट्रिक्स पर विकसित कोशिकाओं से ट्यूबों के विकास की तुलना करना शामिल है। बाह्य मैट्रिक्स एक तहखाने झिल्ली की तरह सार्कोमा कोशिकाओं और उसके मुख्य घटक से अलग सामग्री है laminin, प्रकार चतुर्थ कोलेजन, वृद्धि कारक है और प्रोटेयोग्लाईकैन्स हैं। कुछ यौगिकों जब में ट्यूबों के लिए फार्म सेल की क्षमता पर अलग प्रभाव हैकम वृद्धि कारकों और कम Heparan सल्फेट प्रोटेयोग्लाईकैन्स (HSPGs) के साथ एक वातावरण। HSPGs बाह्य मैट्रिक्स का एक घटक है जो काफी जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स में कम है। एक उदाहरण के रूप में, यदि परिकल्पना ऐसे SB225002, जो ब्लॉक CXCR2 रिसेप्टर, काफी कमजोर ट्यूब गठन जब HSPGs प्रचुर मात्रा में हैं बाधित करने के लिए क्षमता है के रूप में angiogenesis अवरोधकों, तो बाह्य मैट्रिक्स और जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स में ट्यूब गठन गतिविधि के बीच एक तुलना है HSPGs के नियंत्रण के माध्यम से angiogenesis निषेध की संभावना तलाश में महत्वपूर्ण है।
अन्य assays कि आमतौर पर angiogenesis यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है विवो तरीकों में हैं। इस बात का उल्लेखनीय उदाहरण लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) परख 6 चिकन अंडे का उपयोग कर रहे हैं, और इन विवो Matrigel चूहों का उपयोग angiogenesis परख 7 प्लग। इन विवो प्रक्रिया टी में angiogenesis को मापने जबकिhree आयाम और इन विट्रो ट्यूब गठन परख की तुलना में मानव शरीर के अधिक प्रतिनिधि हैं, वे काफी अधिक समय की आवश्यकता के दोष पीड़ित हैं और काफी अधिक प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो जाता है। दोनों सीएएम परख और बाह्य प्लग परख कम से कम एक सप्ताह 8 लेते हैं, क्या करना है, जबकि इसकी तुलना में, ट्यूब गठन परख एक ही दिन में किया जा सकता है और यह जानवर के उपयोग की आवश्यकता नहीं है।
यह ध्यान रखें कि endothelial इस रिपोर्ट में इस्तेमाल किया कोशिकाओं मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। इन कोशिकाओं को संवहनी अंकुर और रक्त वाहिकाओं के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और पर्याप्त कैंसर में endothelial कोशिकाओं के अनुरूप दोनों इन विट्रो और इन विवो प्रयोगों 9 में विरोधी angiogenesis गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं। इस तरह के प्राथमिक microvascular endothelial कोशिकाओं के रूप में अन्य कोशिकाओं को भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
यह भी ध्यान दें कि कम होने के अलावा महत्वपूर्ण हैHSPGs का स्तर, जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स भी कई घटकों का स्तर कम हो गया है जब सामान्य बाह्य मैट्रिक्स की तुलना में। यह भी शामिल है, लेकिन सीमित नहीं है: EGF, IGF-1, PDGF, और TGF-बीटा। उन प्रयोगों प्रदर्शन angiogenesis के संबंध में इन यौगिकों के महत्व का अध्ययन जीएफआर बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करने में रुचि हो सकती है।
जब इस परख का आयोजन, यह सब समय पर बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर बाह्य मैट्रिक्स रखने के लिए जब तक अन्यथा निर्दिष्ट आवश्यक है। बाह्य मैट्रिक्स ऊपर 4 डिग्री सेल्सियस गर्म करने के लिए अनुमति दी है, तो यह भाजन जाएगा, और परख बर्बाद हो जाएगी। यह भी है कि कुछ भी है कि संपर्क में आता है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है (जैसे, pipet सुझावों, प्लेट) बाह्य मैट्रिक्स के साथ पूर्व ठंडा ऊपर उल्लिखित कारण के लिए है। प्रत्येक कुएं में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या महत्वपूर्ण है, बहुत कुछ कोशिकाओं, नियंत्रण नमूना में उम्मीद की वेब नहीं देना होगा भी कई कोशिकाओं बड़े सेल समूहों या एक monolayer बनेगी और परख मान्य नहीं होगा। इस परख की सफलता में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक HUVECs की सेल बीतने संख्या है। बीतने संख्या हमेशा दस से कम होना चाहिए, अन्यथा मजबूत ट्यूब गठन नहीं हो सकता है। इसके अलावा, एक यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सेल संस्कृति के माध्यम से इस्तेमाल किया जा रहा समाप्त हो गया है, या कोशिकाओं व्यवहार्य नहीं होगा। alternatively, एक माध्यम है और इसके घटकों विभाज्य और समाप्ति तिथि के बाद समय की अवधि के लिए संरक्षित करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर कर सकते हैं। बेशक, यह अभी भी समाप्ति की तारीख से पहले माध्यम का उपयोग करने के लिए बेहतर है
सभी प्रक्रियाओं की तरह, वहाँ endothelial सेल ट्यूब गठन परख का आयोजन करने के लिए कुछ नुकसान कर रहे हैं। एक प्रमुख समस्या यह है कि, क्योंकि वहाँ endothelial कोशिकाओं और समर्थन matrices के विभिन्न प्रकार के होते हैं, परख के परिणामों पर जो सेल और मैट्रिक्स के प्रकार के आधार पर किया जाता है, बहुत भिन्न हो सकते है। endothelial इस्तेमाल कोशिकाओं (HUVECs, HAECs या HMVECs) प्राथमिक कोशिकाओं, वे अमर कोशिकाओं की तुलना में पाने के लिए और परिवर्तनशीलता के लिए करना महंगा हो रहे हैं। प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के लिए सीमित मार्ग है, और इसलिए लंबी अवधि के angiogenesis प्रयोगों 14 के लिए उपयुक्त नहीं हैं। विश्वसनीय डेटा के लिए, एक हमेशा परख के लिए एक ही प्रकार का उपयोग करना चाहिए। इन विट्रो assays में दूसरे के साथ के रूप में, एक ट्यूब गठन परख के परिणामों को चुनाव होना चाहिए, विवो में मजबूती आई है क्योंकि दो आयामी टिशू कल्चर के नियंत्रण में है और कृत्रिम स्थितियों से परिणाम हमेशा एक जीवित जीव की जटिल Biosystem में परिलक्षित नहीं किया जा सकता है। यह भी महत्वपूर्ण है कि परख के इस प्रकार के केवल endothelial सेल ट्यूब गठन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ध्यान में रखना ट्यूब बनाने कोशिकाओं है, और दूसरे, गैर endothelial परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।
इस परख एक यौगिक के एन्जियोजेनिक संभावित यों तो एक नहीं बल्कि सरल और त्वरित तरीका है। यह भी आगे के प्रयोगों के लिए एक मंच का निर्माण करती है, अकेले रूप में, यह है जिसके द्वारा यौगिक वास्तव में पोत बनाने की प्रक्रिया को प्रभावित करता है विशिष्ट तंत्र के बारे में जानकारी उपज नहीं है। हालांकि, विभिन्न बाह्य matrices के उपयोग कैसे आगे जो आमतौर पर इस्तेमाल नहीं किया है अनुसंधान के सवालों के लिए एक रूपरेखा बनाने के लिए एक उदाहरण है। वहाँ विशिष्ट अवरोधकों कि के घटकों को निशाना सहित परिसर के विशिष्ट जैव रासायनिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण हैंangiogenesis मार्ग। एक और दृष्टिकोण endothelial कोशिकाओं से शाही सेना को निकालने और आरटी पीसीआर (रियल टाइम पीसीआर) 12 उपयोग जीन अभिव्यक्ति की परिवर्तन जो परख में मनाया विकास व्यवहार का कारण बन सकता का विश्लेषण करने के लिए हो सकता है। इस विधि का भविष्य अनुप्रयोगों angiogenesis मार्ग की विशेष कदम के लिए तोड़े नीचे assays बनाने के लिए HUVECs ट्रांसफ़ेक्ट शामिल हैं। वहाँ lymphangiogenesis मार्ग का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करने की क्षमता है। बाह्य मैट्रिक्स घटकों में फेरबदल करके, मैट्रिक्स और सेलुलर प्रक्रिया के कैंसर में angiogenesis समर्थन की बातचीत आगे स्पष्ट किया जा सकता है। इन विशेष परिस्थितियों में endothelial कोशिकाओं से शाही सेना और प्रोटीन की निकासी के अतिरिक्त मात्रात्मक डेटा डेटा इमेजिंग के लिए इसी प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |