Strategisk endotelcelle Tube Dannelse analyse: Sammenligning ekstracellulær matriks og Growth Factor Redusert ekstracellulær matriks

Summary

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Abstract

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis¹. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

Introduction

For å oppnå de næringsstoffer som er nødvendig for å overleve, maligne tumorer krever adgang til pasientens blodstrøm. For å få tilgang til det, tumorceller frigjør kjemiske signaler som stimulerer veksten av nye blodkar i tumoren, og dermed kapre den normale fysiologiske prosess som er kjent som angiogenese ^2. Det er også gjennom blodårene opprettet via angiogenese at metastase (dvs. spredning av kreft til andre organer) kan forekomme. Fordi prosessen med angiogenese er så viktig for utviklingen av en slik rekke kreftformer, er det et attraktivt mål i anticancerterapi forskning ^3.

En metode som brukes til å kvantifisere angiogenese er å måle endotel progenitor-cellens evne til å danne rør når den plasseres på en ekstracellulær matriks. Ettersom dannelsen av disse rør er en kritisk tidlig trinn i angiogenese, testing av miljøbetingelser (for eksempel, tilstedeværelse eller mangel på en gitt compound) som kan stimulere eller hemme tube dannelse gir innsikt i konkrete tiltak som kan være målrettet for å hemme angiogenese. Endotelcelle røret dannelsesbestemmelsen er en av de mest brukte ⁴ in vitro metoder som måler cellenes evne til å danne rør. Det er en enkel analyse, noe som krever forholdsvis få komponenter og en kort kulturperiode ^5. Kanskje aller viktigst, er imidlertid at dataene oppnådd fra denne type analyse er målbare.

Et eksempel for anvendelse av røret formasjonen analysen er å sammenligne utviklingen av rørene fra vaskulære endotelceller dyrket på ekstracellulær matriks vs. vekstfaktor reduseres (GFR) ekstracellulære matriks. Den ekstracellulære matriks er et basalmembran-liknende materiale isolert fra sarkomceller og dets hovedkomponenter er laminin, kollagen type IV, vekstfaktorer og proteoglykaner. Noen forbindelser har ulik effekt på cellenes evne til å danne rør når iet miljø med reduserte vekstfaktorer og reduserte heparansulfat proteoglykaner (HSPGs). HSPGs er en komponent av den ekstracellulære matriks som er betydelig redusert i GFR ekstracellulær matriks. Som et eksempel, hvis den hypotese er at angiogenese-inhibitorer, slik som SB225002, som blokkerer CXCR2 reseptoren, har vesentlig svakere evne til å avbryte rør dannelse når HSPGs er rikelig, og deretter en sammenligning mellom rør formasjon aktivitet i ekstracellulære matriks og GFR ekstracellulære matriks er viktig i å utforske muligheten for angiogenese hemming via kontroll av HSPGs.

Andre analyser som ofte brukes for å bestemme effektene av forbindelsene på angiogenese er in vivo metoder. Kjente eksempler på dette er dama chorioallantoic membran (CAM) assay ⁶ bruker kylling egg, og in vivo Matrigel plugg angiogenese analysen ⁷ ved hjelp av mus. Mens in vivo metoder måle angiogenese i three dimensjoner og er mer representative for den menneskelige kroppen sammenlignet med in vitro-rør-analysen, lider de av den feil at den krever betydelig mer tid og er betydelig mer vanskelig å utføre. Både CAM-testen og den ekstracellulære pluggen analysen ta minst en uke ⁸ for å gjøre, mens i sammenligning, kan røret dannelsesbestemmelsen gjøres i en enkelt dag, og det krever ikke animalsk bruk.

Det er viktig å merke seg at endotelcellene som brukes i denne rapport er humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC). Disse cellene spiller en sentral rolle i vaskulære spire og vekst av blodkar, og er tilstrekkelig analog til endotelceller i krefttyper som skal benyttes for å vurdere anti-angiogenese aktivitet både in vitro og in vivo eksperimenter ^9. Andre celler så som primære mikrovaskulære endotelceller kan også anvendes.

Det er også viktig å merke seg at i tillegg til å ha laverenivåer av HSPGs, har GFR ekstracellulære matriks også reduserte nivåer av mange komponenter i forhold til det normale ekstracellulære matriks. Dette omfatter, men er ikke begrenset til: EGF, IGF-1, PDGF, og TGF-beta. De utfører eksperimenter studerer betydningen av disse forbindelsene i forhold til angiogenese kan være interessert i å bruke GFR ekstracellulære matrise.

Protocol

1. Cell Culture Seed 3×10 5 HUVEC-celler i 10 ml komplett vekstmedium 10 i en 75 cm kolbe. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO 2 til 70-80% konfluens. 2. tubule Dannelse analysen Tine enten vekstfaktor-redusert (GFR) ekstracellulære matrise eller normal ekstracellulære matrise over natten på isen ved 4 ° C. Merk: For korthets skyld 'ekstracellulære matrix "vil heretter bli brukt til å referere både GFR og normal ekstracellulære matrise. Fremgangsmåten for å fremstille dem er identiske. Hold 96-brønners kulturplater på is, og tilsett 50 mL av kjølt ekstracellulære matrise per brønn med forhåndskjølte tips. Forbered triplikat av 5 brønner inneholdende bare den normale ekstracellulære matriks. Forbered et annet tre eksemplarer av 5 brønner som kun inneholder GFR ekstracellulære matrise. Inkuber 96-brønners plate ved 37 ° C i 30 minutter. Vask HUVECsen gang med fosfat-bufret løsning uten kalsium og magnesium (PBS), og tilsett 1 ml 0,05% trypsin-EDTA. Inkuber fatet ved 37 ° C i 1-5 minutter, sjekke cellene hvert minutt før de fleste cellene runde opp. Løsne cellene ved å trykke på kolben gang. Tilsett 5 ml basalmedium (dvs. endotelial cellevekstmedium uten noe (f.eks tilskudd) tilsatt) med 1% føtalt bovint serum (FBS). Samle cellene i kolben ved pipettering og overfør til et 15 ml rør. Sentrifuger cellene ved 200 xg i 5 minutter og kast supernatanten. Re-suspendere med 2 ml basal medium, telle cellene ved hjelp av en hemocytometer og justere cellekonsentrasjonen til 2-3 x 10 5 celler / ml. Fremstille 100 ul av de følgende 10x konsentrasjoner av CXCR2 inhibitor SB225002 i basalmedium: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM og 0 pM (kontroll). Pipetter 300 mL av HUVEC suspensjon i hver 5 microcentrifuge rør. Legg 33 ul av inhibitoren konsentrasjoner (11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 uM, 0 mm) inn i et rør som hver inneholder den HUVECs, og virvle. Pipetter 50 ul av hver av cellesuspensjoner (1-1,5 x 10 4 celler) til individuelle brønner av ekstracellulær matriks. Plate hver suspensjon i triplikat og inkubert i 4-16 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Etter 4-16 timer, ta 4 bilder av rørene dannet per brønn med en invertert mikroskop kamera 11 (opprinnelig forstørrelse x 100). 3. tubule Forstyrrelse analysen Klargjør ekstracellulære matrise og plater i henhold til de samme spesifikasjonene som den Tube Dannelse analysen (trinn 2.1 til 2.3). Forbered HUVEC suspensjon som beskrevet i trinn 2.4- 2.4.2 røret Formation Assay og delmengde inn i en 96-brønners plate inneholdende den ekstracellulære matriks ved 50 ul per brønn. Merk: Plate nok brønner so at det er 3 brønner per behandling. Dyrke cellene på ekstracellulær matriks i 4 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Ta bilder før oppstart av medikamentell behandling. Fremstille 2 x konsentrasjoner av CXCR2-inhibitor SB225002 som beskrevet i trinn 2,5 i røret formasjonen analysen, og tilsett 50 ul av hver konsentrasjon per brønn av 96-brønners platen inneholdende HUVECs. Plate hver konsentrasjon i triplikat. Inkuber platen for en annen 2-12 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Ta 4 bilder av rørene dannet i hver brønn ved bruk av et invertert mikroskop kamera (opprinnelig forstørrelse x 100) 11. 4. kvantifiseringsmetoder Vurdere tube formasjon fanget i bildene ved å måle den totale tube lengde på rør i fire tilfeldige mikroskopiske felt ved hjelp av mikroskop kameraprogramvaren. Åpne bildet i mikroskop kameraprogramvaren, og klikk "Merknader og målinger9 ;. Under "lengde" velger den "enkle linjen" verktøy. Klikk på bildet, så trekke en linje langs lengden av røret, deretter høyreklikk. Merk: Programvaren vil automatisk beregne lengden av linjen i piksler, og sette inn data i en fil. Gjenta prosedyren for alle tube linjer i bildet ved å velge "enkel linje" verktøy. Klikk på bildet, så trekke en linje langs lengden av røret, deretter høyreklikk. Merk: Programvaren vil registrere lengden av hver linje og vise dataene på skjermen. Etter måling hver tube i bildet, klikk "Export", så valgte 'Lengde til regneark ". Merk: Lengde data vil bli eksportert til et regneark. Legg alle rør lengder fra regnearket for å få total rørlengde. Beregn og registrere den gjennomsnittlige lengden på rørene. Merk: Fire gjentak anbefales med gjennomsnitt og standardavvik bestemt. 5. Gjenopprette Celler fra den ekstracellulære matriks Culture Kultur og utføre et rør formasjon analyse (se avsnitt 2) i større målestokk i en 96-brønners plate vil ikke gi tilstrekkelig legemer. For 12 brønners plater ved å bruke 500 pl av ekstracellulær matriks og 500 ul av den HUVEC cellesuspensjonen (1.5×10 5-celler). Inkuber cellene i 4-16 timer for å danne rør. Deretter aspireres cellekulturmediet. Rens cellene med 1 ml kald 1 x PBS uten kalsium og magnesium. Tilsett 1 ml av iskald PBS-2,5 mM EDTA buffer på kulturen og holde på is i 10 min. Løsne cellene og ekstracellulære matrise blanding fra fatet ved hjelp av en 1000 mL pipette med tips avskåret, og deretter overføre til en kald 15 ml tube, vaske godt med 4 ml iskald PBS-2,5 mM EDTA og satt inn i røret . Sett rørene på is for 1-4 timer og snu røret et par ganger før alle de ekstracellulærematriks er oppløst. Sentrifuger i 10 minutter ved 1620 x g ved 0 ° C Re-suspendere cellen pellets med 1 ml kald PBS til en 1.ml tube på is. Sentrifuger på nytt i 5 min ved 3000 x g ved 0 ° C, deretter kastes supernatanten. Oppbevar cellene i -80 ° C.

Representative Results

Betydelig, sunn endothelial tube dannelse kan lett kontrast til hemmet tube dannelse i mikroskopi bilder. Sunn rør formasjon fremstår som en organisert bane av kapillær-lignende strukturer (figur 1). Til sammenligning manifesterer hemmet rør formasjon seg ​​som spredte celler (figur 2). Rør formasjonsanalysedata er kvantifisert ved å måle den totale rørlengden av kapillarrør (tabell 1). Foruten totale rørlengde, kan den gjennomsnittlige slangelengden, totalt antall rør, eller det totale antallet forgreningspunkter måles. Strukturert tube dannelse gir større netto rørlengde enn spredt hemmet tube vekst. I figur 3 tillater en doseresponskurve beregning av IC50 under de eksperimentelle betingelsene for HUVECs på GFR ekstracellulære matriks og en CXCR2 inhibitor SB225002. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"> Figur 1. Endothelial t ube dannelse på ekstracellulær matrise og vekstfaktor-redusert (GFR) ekstracellulær matriks. To bilder viser vellykkede rør dannelse på ekstracellulære matriks (A) og GFR ekstracellulære matriks (B). Den sammenhengende nettverk av rør viser tydelig at veksten av rør er sunt i disse HUVECs. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2. Hemming av rør formasjon på ekstracellulære og vekstfaktor-redusert (GFR) ekstracellulære matrise av en CXCR2 inhibitor SB225002 (5,6 mm). To bilder viser tubeformasjonen som har blitt hemmet av en CXCR2 inhibitor SB225002 (5,6 uM) av ekstracellulær matriks (A) og GFR ekstracellulære matriks (B). De isolerte klumper av HUVEC-celler sett i dette bilde viser at cellene ikke var i stand til å danne rørene er nødvendige for å koble seg til hverandre. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3. Doseresponskurven på vekstfaktor-redusert (GFR) ekstracellulær matriks. X-aksen viser slangelengden og Y-aksen viser konsentrasjonen av et CXCR2 inhibitor. Doseresponskurven viser at HUVEC respons på CXCR2 inhibitoren på GFR ekstracellulære matriks er doseavhengig. IC 50 (halv maksimal inhibitory konsentrasjon) ble beregnet ved hjelp av programvare 13 og kan sammenlignes med en doseresponskurve for ekstracellulær matriks, for eksempel. IC50 er den konsentrasjon av inhibitor som reduserer responsen til 50%. Feilfelt representerer standardavvik. Growth Factor Redusert (GFR) ekstracellulære matrise og inhibitor (4 gjentak) Total rørlengde Gjennomsnittlig (piksler) (1 pixel = 0,34 mikrometer) standard~~POS=TRUNC avvik~~POS=HEADCOMP P-verdi GFR ekstracellulære matrise kontroll 2447 168,174 GFR ekstracellulære matrise + 0,56 mikrometer SB225002 1422,5 185.4218 0.000395 GFR ekstracellulære matrise + 1,1 mikrometer SB225002 1004 126.1784 2,14 x 10 -5 GFR ekstracellulære matrise + 5,6 mikrometer SB225002 519,25 129.6368 4,19 x 10 -6 GFR ekstracellulære matrise + 11 mikrometer SB225002 393,75 212.6857 1,21 x 10 -5 Tabell 1. Kvantifisering totale tube lengder på vekstfaktor-redusert (GFR) ekstracellulære matrise under varierende forhold. En del av en tabell ved hjelp totale tube lengder registrert i prøver dyrket på GFR ekstracellulære matrise med varierende konsentrasjoner av CXCR2 inhibitor. Dataene indikerer at den CXCR2 inhibitoren hemmer rør formasjonen. Inkludert er forbundet verdier som gjennomsnitt av fire replikater, standardavvik, og P-verdi. Målt i piksler for å visedataene som blir eksportert. IC 50 kan beregnes ved å bruke statistiske software 13. (1 pixel = 0,34 mikrometer)

Discussion

Ved å gjennomføre denne analysen, er det viktig å holde den ekstracellulære matriks på is eller ved 4 ° C til alle tider mindre annet er spesifisert. Dersom den ekstracellulære matriks tillates å oppvarmes over 4 ° C, vil den polymerisere, og analysen vil bli ødelagt. Det er også viktig å sikre at alt som kommer i kontakt (f.eks, pipettespisser, plate) med den ekstracellulære matriks er forhåndskjølt til den ovennevnte grunn. Antall celler utsådd i hver brønn er kritisk, vil også få celler ikke gi den forventede nettet i kontrollprøven, for mange celler vil danne store cellegrupper, eller et monolag, og analysen vil ikke være gyldig. En annen viktig faktor i suksessen til denne analysen er cellen passasje nummeret til HUVECs. Passasjen nummer skal alltid være lavere enn ti, ellers kan ikke forekomme robust tube formasjon. I tillegg bør man sørge for at cellekulturmedium som brukes ikke er utløpt, eller cellene vil ikke være levedyktig. alternatively, kan en delmengde mediet og dets komponenter og lagre dem ved -20 ° C for å bevare for en periode av tid etter utløpsdatoen. Selvfølgelig er det fortsatt foretrekke å bruke mediet før utløpsdato

Som alle fremgangsmåter, er det noen ulemper for gjennomføring av endotelcelle røret formasjonsanalyse. Et stort problem er at, fordi det finnes forskjellige typer av endotelceller og støtte matriser, kan resultatene av analysen variere sterkt avhengig av hvilken celletype og matriks anvendt. Endotelcellene brukes (HUVECs, HAECs eller HMVECs) er primære celler, de er kostbare å få og ha variasjon i forhold til udødelig celler. Den primære celler har begrensede passasjer for bruk, og er derfor ikke egnet for langsiktig angiogenese eksperimenter ^14. For pålitelige data, bør man alltid bruke de samme typene for analysen. Som med andre in vitro-analyser, bør resultatene av et rør formasjon assay være conbekreftet in vivo, fordi resultater fra de kontrollerte og kunstige forhold med to-dimensjonal vevskultur ikke alltid bli reflektert i komplekset Biosystem av en levende organisme. Det er også viktig å huske på at denne type av test kan bare brukes for å demonstrere endotelcelle rør formasjon, og skal ikke benyttes til å teste andre, ikke-endotel, rør dannende celler.

Denne analysen er en relativt enkel og rask metode for å kvantifisere angiogenic potensialet av en forbindelse. Den danner også en plattform for videre eksperimenter, som alene, vil det ikke gi informasjon angående den spesielle mekanisme ved hjelp av hvilken forbindelsen faktisk påvirker fartøyet formingsprosessen. Imidlertid er bruken av variert ekstracellulære matriser et eksempel på hvordan man videre legge til rette for problemstillinger som ikke er vanlig brukt. Det er tilnærminger til å studere de spesifikke biokjemiske mekanismer i forbindelse inkludert spesifikke hemmere som er rettet mot komponenter avden angiogenese pathway. En annen tilnærming kan være å ekstrahere RNA fra endotelceller og bruke RT-PCR (Real Time PCR) ¹² for å analysere endringer i genekspresjon som kan forårsake vekst oppførsel observert i analysen. Fremtidige anvendelser av denne fremgangsmåte omfatter transfektert HUVECs for å skape knock-down-analyser for bestemte trinn av angiogenese pathway. Det er potensial for å bruke denne tilnærmingen til å studere lymphangiogenesis veien. Ved å endre de ekstracellulære matriks-komponenter, kan vekselvirkningen mellom matrisen og cellulær prosess støtte angiogenese i kreft bli ytterligere belyst. Utvinning av RNA og proteiner fra endotelceller under disse spesielle forhold gi ytterligere kvantifiserbare data tilsvarende bildebehandling data.

Materials

EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )	Fisher	NC9525043	HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.  Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm  in 37 oC  before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free	Fisher	CB-40230	Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in   -20 oC , warm in 4 °C  before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free	Fisher	CB-40234	extracellular matrix, keep in   -20 oC, warm in 4 °C  before use.
SB225002	Fisher	559405	CXCR2 inhibitor, keep in   -20 oC, warm in room temperature  before use.
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ScienCell Research Laboratories	8000	culture it according reference  10.
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red	Invitrogen	25300-054	keep in 4 oC, warm  in 37 oC  before use.
Nikon ECLIPSE Ti	Nikon		Inverted Research Microscope.
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit	Nikon		Inverted Research Microscope software
Graph-pad Prism 5	GraphPad Software, Inc.		scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50.