This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.
Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient’s blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.
I syfte att erhålla de näringsämnen som är nödvändiga för överlevnad, maligna tumörer kräver tillgång till patientens blodström. Att få att tillgång, tumörceller frigör kemiska signaler som stimulerar tillväxten av nya blodkärl till tumören och därmed kapa den normala fysiologiska process som kallas angiogenes 2. Det är också genom blodkärlen som skapas via angiogenes att metastaser (dvs spridning av cancer till andra organ) kan förekomma. Eftersom processen av angiogenes är så avgörande för utvecklingen av en sådan mängd olika cancerformer, är det ett attraktivt mål i cancerbehandling forskning 3.
En metod som används för att kvantifiera angiogenes är att mäta den endoteliala progenitorceller cellens förmåga att bilda rören när de placeras på en extracellulär matris. Eftersom bildningen av dessa rör är ett kritiskt tidigt steg i angiogenes, testa miljöförhållanden (t.ex. närvaro eller avsaknad av en viss compound) som kan stimulera eller hämma rör bildning ger en inblick i specifika åtgärder som kan riktas för att hämma angiogenes. Endotelceller röret bildningsanalys är ett av de mest använda 4 in vitro-metoder som mäter cellernas förmåga att bilda rören. Det är en enkel assay, som kräver relativt få komponenter och en kort odlingsperiod 5. Kanske viktigast av allt är dock att de uppgifter som erhållits från denna typ av analys är mätbara.
Ett exempel för användningen av röret bildningsanalys involverar att jämföra utvecklingen av rören från vaskulära endotelceller odlade på extracellulära matrisen vs. tillväxtfaktor minskas (GFR) extracellulära matrisen. Den extracellulära matrisen är en basalmembranliknande material isolerat från sarkomceller och dess huvudkomponenter är laminin, typ IV-kollagen, tillväxtfaktorer och proteoglykaner. Vissa föreningar har olika effekter på cellens förmåga att bilda rören när de är ien miljö med minskade tillväxtfaktorer och minskade heparansulfatproteoglykaner (HSPGs). HSPGs är en komponent i den extracellulära matrisen som avsevärt reduceras i GFR extracellulära matrisen. Som ett exempel, om hypotesen är att angiogeneshämmare, såsom SB225002, som blockerar CXCR2 receptor, har betydligt svagare förmåga att avbryta rörbildning när HSPGs är riklig, sedan en jämförelse mellan rörbildning aktivitet i extracellulär matrix och GFR extracellulär matris är viktigt att utforska möjligheten att angiogeneshämning via kontrollen över HSPGs.
Andra analyser som vanligen används för att bestämma effekterna av föreningar på angiogenes är in vivo-metoder. Noterbara exempel på detta är chick korioallantoinmembranet (CAM) -analys 6 med hjälp av hönsägg, och in vivo Matrigel plug angiogenes analys 7 med hjälp av möss. Medan in vivo metoder mäter angiogenes i tRE dimensioner och är mer representativ för den mänskliga kroppen jämfört med den vitro rörbildning analysen in, lider de felet att de kräver betydligt mer tid och är betydligt svårare att utföra. Både CAM-analysen och den extracellulära plug-analysen tar minst en vecka 8 att göra, medan i jämförelse, kan röret bildningsanalys göras på en enda dag och det kräver inte användningen av djur.
Det är viktigt att notera att de endoteliala cellerna som används i denna rapport är humana navelvenendotelceller (HUVEC). Dessa celler spelar en viktig roll i vaskulär grodd och tillväxt av blodkärl, och är tillräckligt analog till endotelceller i cancer som ska användas för att utvärdera anti-angiogenes aktivitet både in vitro och in vivo experiment 9. Andra celler såsom primära mikrovaskulära endotelceller, kan också användas.
Det är också viktigt att notera att förutom att ha lägrenivåer av HSPGs har GFR extracellulära matrisen också reducerade nivåer av många komponenter i jämförelse med normala extracellulära matrisen. Detta inkluderar, men är inte begränsat till: EGF, IGF-1, PDGF, och TGF-beta. De utför experiment som studerar betydelsen av dessa föreningar i förhållande till angiogenes kan vara intresserade av att använda GFR extracellulära matrisen.
Vid utförande av denna analys är det viktigt att hålla den extracellulära matrisen på is eller vid 4 ° C vid alla tidpunkter om inte annat anges. Om den extracellulära matrisen tillåts värmas över 4 ° C, kommer den att polymerisera, och analysen kommer att förstöras. Det är också viktigt att se till att allt som kommer i kontakt (t ex, pipettspetsar, den platta) med den extracellulära matrisen är förkylts av nyss nämnda skäl. Antalet celler sådda i varje brunn är kritisk, kommer alltför få celler inte ge den förväntade banan i kontrollprovet, för många celler kommer att bilda stora cellkluster eller ett monoskikt och analysen kommer inte att vara giltig. En annan viktig faktor i framgången för denna analys är cellpassagen numret på HUVEC. Passageantalet bör alltid vara lägre än tio, annars robust rör bildning får inte förekomma. Dessutom bör man se till att cellodlingsmediet som används inte har löpt ut, eller att cellerna inte kommer att vara livskraftiga. Alternattivt, kan en alikvot på medellång och dess komponenter och förvara dem vid -20 ° C för att bevara för en tidsperiod efter slutdagen. Naturligtvis är det fortfarande fördelaktigt att använda mediet före utgångsdatum
Liksom alla förfaranden, finns det vissa nackdelar som att genomföra de endotelcell röret bildningsanalys. Ett stort problem är att, eftersom det finns olika typer av endotelceller och stödmatriser, kan resultaten av analysen variera mycket beroende på vilken typ av cell och matris används. Endotelcellerna som används (HUVEC, HAECs eller HMVECs) är primära celler, de är dyra att få och ha variation jämfört med odödliggjorda celler. De primära cellerna har begränsade passager för användning, och är därför inte lämplig för långtidsangiogenesförsök 14. För tillförlitliga uppgifter, bör man alltid använda samma typ för analysen. Som med andra in vitro-analyser, bör resultaten av ett rör bildningsanalys vara conbekräftas in vivo, eftersom resultaten från de kontrollerade och konstgjorda villkor för tvådimensionella vävnadskultur inte alltid kan återspeglas i den komplexa biosystem av en levande organism. Det är också viktigt att komma ihåg att denna typ av analys endast kan användas för att visa endotelceller rör bildning, och bör inte användas för att testa andra icke-endotelceller, rör bildande celler.
Denna analys är en ganska enkel och snabb metod för att kvantifiera angiogena potentialen hos en förening. Den bildar också en plattform för ytterligare experiment, som ensam, betyder inte att ge information avseende den specifika mekanism genom vilken föreningen som faktiskt påverkar fartyget formningsprocessen. Emellertid är användningen av olika extracellulära matriser ett exempel på hur man ytterligare kan skapa en ram för forskningsfrågor som inte är vanligt förekommande. Det finns metoder för att studera specifika biokemiska mekanismer för föreningen, inklusive specifika hämmare som riktar komponenter iden angiogenes-vägen. En annan strategi kan vara att extrahera RNA från endotelceller och använda RT-PCR (Real Time PCR) 12 för att analysera förändringar av genexpression som kan göra att tillväxtbeteende observeras i analysen. Framtida tillämpningar av denna metod innefattar transfekterade HUVEC att skapa knock-down analyser för specifika steg i angiogenes vägen. Det finns potential att tillämpa denna metod för att studera lymfangiogenes vägen. Genom att ändra de extracellulära matrixkomponenter, kan interaktionen mellan matrisen och cellulär process stödjer angiogenes i cancer att belysas ytterligare. Utvinningen av RNA och proteiner från endotelceller under dessa särskilda villkor ytterligare kvantifierbara data motsvarande bilddata.
The authors have nothing to disclose.
The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm in 37 oC before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 oC , warm in 4 °C before use. |
MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 oC, warm in 4 °C before use. |
SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 oC, warm in room temperature before use. |
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 oC, warm in 37 oC before use. |
Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |