مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية
Summary
This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Abstract
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
Introduction
في الإصابات العصبية، وغالبا ما يمنعون جذوعها الداني والقاصي العصبية من إعادة تنظيم مباشرة من كراسات العصبية نظرا لموقع الآفة 1-2. عادة، تتكون مساحات محور عصبي حزم أمر غاية والانحياز من المحاور، والتي تشكل شبكات معقدة من الاتصال. ومع ذلك، وتجديد الأعصاب هو عملية الفوضى بسبب سوء التنظيم محور عصبي محاذاة 3-4. لذلك، لتوليد عدد كاف من تجديد المحاور التي ردم موقع الآفة، فمن الضروري للحث على محاذاة محور عصبي منظمة تنظيما جيدا. بالإضافة إلى ذلك، إزالة الميالين يصاحب الإصابات العصبية بسبب موت الخلايا myelinating في موقع الإصابة. منذ إزالة الميالين يضعف بشدة قدرة موصلة للبقاء محاور وعلاجات تستهدف إزالة الميالين أو تشجيع عودة الميالين هامة للانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب 5. وبالتالي فإن الهدف من هذا البروتوكول هو لتوضيح نهج الهندسية التي تعالج هاتين المسألتينتجديد الأعصاب.
وقد تم تطبيق تباين السطح، الذي يعرف بأنه الفرق، عند قياسها على طول محاور مختلفة، في الخصائص الفيزيائية أو الميكانيكية مادة، والتأثير على محاذاة الخلية، والنمو، والهجرة 6-7. بالإضافة إلى طبوغرافية، هناك طرق أخرى للحث على تباين. في وقت سابق، ونحن التحقيق تباين سطح الناجم عن ميكانيكي ثابت قبل تمتد من بولي ميثيل-siloxane (PDMS) الغشاء. نظرية "سوبر تشوه صغير المفروض على كبير" توقعت أن تصلب فعالة الخلايا تستشعر في الاتجاه امتدت يختلف عن اتجاه عمودي، وليس هذا الاختلاف في صلابة فعالة يرجع إلى السطح تباين 8. الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) مثقف على غشاء PDMS امتدت قبل قادرة على الشعور تباين عن طريق سحب بنشاط السطح ونتيجة لذلك، محاذاة في الاتجاه امتدت قبل 9. وبالمثل، وهو ع سطح متباينإيسينج من سطح امتدت قبل ميكانيكي يؤثر على المحاذاة، فضلا عن النمو وتكون الميالين من عقدة الجذر الظهري (DRG) محاور 10. نحن هنا نقدم بروتوكول لإحداث تباين السطح على ساكنة امتدت ما قبل الركيزة PDMS لتعزيز تجديد أكسون 10.
للحصول محاذاة المحور، ملامح الطوبوغرافية مع أنماط المطلوب، ذكرت لتوفير التوجيه الاتصال من خلال الألياف وقنوات 6،11-12 الانحياز، وقد تجلت لتسهيل محور عصبي محاذاة 11،13. ومع ذلك، ذكرت تقنيات لإحداث المواءمة محور عصبي من خلال الميزات الطوبوغرافية، مثل الألياف والقنوات والزخرفة، لم يتمكنوا من إطالة وزيادة سماكة من المحاور. في المقابل، تدريجيا الميكانيكية تمتد أدت إلى محاذاة محور عصبي في الاتجاه تمتد مع محاور أطول وأكثر سمكا التي زادت مع حجم امتداد 14. ومع ذلك، يتضمن جهاز بمحرك في الجسم الحي ليسعمليا. في المقابل، ثابت قبل امتدت-تباين الناجم أقل تعقيدا ويمكن إدراجها بسهولة أكبر إلى تصاميم سقالة المستقبلية للتطبيقات في الجسم الحي.
في هذا البروتوكول، ويستخدم نظام زراعة الخلايا امتدت قبل ساكنة للحث على تباين السطح دون ملامح الطوبوغرافية. ويتكون نظام ثقافة امتدت مسبقا من غشاء PDMS، إطار لمط ومرحلة تمتد، وعندها يتم إصلاح غشاء على الإطار ويتم تطبيق قوته تمتد محددة سلفا على مرحلة تمتد. ويتم رصد الخلايا العصبية DRG المعزولة حديثا مثقف على سطح امتدت قبل لمدة تصل إلى 21 يوما للمحاذاة محور عصبي وسمك. وفي وقت لاحق، خلايا شوان (المنبوذة) شارك في تربيتها مع ومراقبتها لتكون الميالين المحاور الانحياز. من خلال دمج ما قبل امتداد الناجم عن تباين سطح تمكنا من تعزيز خلية الانحياز التمايز ومحور عصبي الانحياز نمو اللجان الدائمة والخلايا العصبية DRG 9-10، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحث على محاذاة محوار على سطح امتدت مسبقا، هناك نوعان من الخطوات الحاسمة: 1) يجب أن يكون غشاء PDMS مسطحة وسمك متجانس. و2) يجب إزالة الخلايا الدبقية من DRG. بعد خلط PDMS وcrosslinker وعلاج في الفرن، يجب أن تبقى جل PDMS crosslinked على قمة مقاعد البدلاء شقة والتعامل معها بعناية لتجنب أي إمال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر اريك فاسكو لمساعدته في إعداد ركائز PDMS، الدكتور Shiyong وانغ في مختبر الدكتور مرسى ماتا في جامعة ميشيغان للحصول على اقتراحات مفيدة والتدريب من العزلة DRG، والدكتور مارك Tuszynski والدكتور دبليو ماري كامبانا في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو للحصول على اقتراحات مفيدة وبروتوكول لعزل SC. وأيد هذه الدراسة في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية (CBET 0941055 وCBET 1510895)، والمعهد الوطني للصحة (R21CA176854، R01GM089866، وR01EB014986).
Materials
| Polydimethylsiloxane （PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
| 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
| FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
| Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
| Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
| then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
Referências
- Liu, C., et al. . Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. . Organosilicon Materials. , (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
