En tilnærming for å forbedre Justering og myelination av Dorsal Root ganglion nevroner

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

I nerveskader, blir de proksimale og distale nervestumpene ofte hindres fra direkte omstillingen av nerve fascicles på grunn av lesjon området ^1-2. Normalt er axon traktater inneholder meget bestilt og justert bunter av aksoner, som danner komplekse nettverk av tilkoblingsmuligheter. Imidlertid er nerve regenerering en kaotisk prosess på grunn av dårlig organisert axon justering ^3-4. Derfor, for å generere et tilstrekkelig antall regenerering av aksoner som bro over lesjon området, er det nødvendig å indusere godt organisert aksonal innretting. I tillegg følger demyelinisering nerveskader som følge av dødsfallet av myelinerende celler på skadestedet. Siden demyelinisering sterkt svekker ledende kapasitet til å overleve aksoner, behandlinger rettet mot demyelinisering eller fremme remyelinisering har betydning for funksjonell bedring etter nerveskade ^5. Dermed målet med denne protokollen er å illustrere en teknisk tilnærming som tar disse to spørsmåleneav nerve regenerering.

Overflate anisotropi, som er definert som en forskjell, da målt langs forskjellige akser, i en materialenes fysikalske eller mekaniske egenskaper, har vært anvendt for å påvirke celle innretting, vekst og migrasjon ^6-7. I tillegg til topografi, finnes det andre metoder for å indusere anisotropi. Tidligere undersøkte vi overflaten anisotropi indusert av mekanisk statisk pre-strekning av poly-dimetyl-siloksan (PDMS) membran. Teorien om "liten deformasjon super pålagt store" spådd at den effektive stivhet cellene fornemme i strukket retning avviker fra den vinkelrett retning, og denne forskjellen i effektiv stivhet skyldes overflate anisotropi ^8. Mesenchymale stamceller (MSC) dyrket på en på forhånd strukket PDMS membran er i stand til å avføle anisotropien ved aktivt å trekke overflaten og som et resultat, justere i forstrukket retning ^9. Tilsvarende en anisotropisk overflate arisere fra en mekanisk pre-strukket overflaten påvirker justeringen, samt vekst og myelination av dorsal root ganglion (DRG) aksoner ^10. Her gir vi en protokoll for å indusere overflate anisotropi på en statisk pre-strukket PDMS underlaget for å forbedre axon regenerering ^10.

For å lokke fram axon innretting, topologiske egenskaper med ønskede mønstre, rapportert å gi kontakt veiledning gjennom orienterte fibre og kanaler ^6,11-12, ble demonstrert for å lette axon justering ^11,13. Imidlertid rapporterte teknikker for å indusere axon innretting gjennom topologiske trekk, såsom fibre, kanaler og mønstring, ikke var i stand til å forlenge og øke tykkelsen av aksonene. I motsetning til dette gradvis mekanisk strek ført til axon innretting i strekkretningen med lengre og tykkere aksoner som økte med størrelsen av den strekning ^14. Imidlertid, som omfatter en motordrevet anordning in vivo er ikkegjennomførbar. I kontrast, er statisk pre-strukket indusert anisotropi mindre komplisert og kan lettere innarbeidet i fremtidige stillas design for in vivo-applikasjoner.

I denne protokollen, er en statisk forstrukket cellekultursystem som brukes for å indusere overflate anisotropi uten topologiske egenskaper. Den forstrukket kultursystem er sammensatt av en PDMS-membran, en strekkramme og en strekking stadium, hvoretter membranen er festet til rammen og en på forhånd bestemt strekning størrelse blir påført på strekketrinnet. Fersk isolerte DRG nerveceller dyrket på pre-strukket overflate for opp til 21 dager overvåkes for axon justering og tykkelse. Deretter Schwann celler (SCS) co-dyrket med de flukt axoner overvåkes for myelination. Ved å innlemme pre-stretch indusert overflate anisotropi vi var i stand til å forbedre celle alignment-differensiering og axon alignment-vekst av MSC og DRG nevroner ^9-10, henholdsvis.

Protocol

Alle prosedyrer for isolering av cellene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Michigan State University. 1. Utarbeidelse av pre-strukket Anisotropic Surface Blande en 10: 1 løsning av base og herder og hell blandingen i en vevskulturskål (12 cm diameter). Bruk 4900 mg base og 490 mg herdemiddel for den totale tverrbindingsmonomer blanding. Hold gel blandingen under vakuum i 20 min for å fjerne luftbobler. Plassere gelen blandingen i ovnen for herding nat…

Representative Results

Den pre-strukket cellekultur system fremmet DRG axon justering 10. DRG nevroner ble dyrket på pre-strukket og unstretched overflater i 12 dager. Aksonene ble farget for β-III-tubulin å demonstrere sin innretting. Figur 2 sammen axon orientering på pre-strukket og unstretched PDMS underlag etter 12 dager med kultur. DRG-aksoner innrettet parallelt med den strukkede retning, mens de viste tilfeldig innretting, og dannet et sammenkoplet nettverk på den ustru…

Discussion

For å indusere axon innretting på pre-strukket overflaten, er det to viktige trinn: 1) PDMS membranen må være flat og homogen tykkelse; og 2) gliaceller må fjernes fra DRG. Etter blanding av PDMS og kryssbinder og herding i en ovn, bør det tverrbundne PDMS gel holdes på en flat benk og håndteres forsiktig for å unngå vipping. Den oksygenplasma behandling av PDMS membranen bør man innen 6 timer etter PLL belegg, ettersom hydrofilisiteten til overflaten (kreves for cellebinding) etter plasmabehandling dempes ov…

Materials

Polydimethylsiloxane （PDMS)	Dow Corning	SYLGARD 184
Neurobasal Medium 1X	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50X	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100X	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,
			2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml).
FDU and Uridine stock solution			FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC.
			Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC.
			Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,
			then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.