Artigo de método

Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro

DOI:

10.3791/54091

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3 de julho de 2016

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1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Um protocolo é apresentada para recolher e descontaminar núcleos permafrost de solos e gelo. A ausência de colónias exógenas e DNA sugerem que os microrganismos detectados representam o material, em vez de contaminação de perfuração ou de processamento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram em condições ambientais passadas. Na verdade, esses materiais congelados podem refletir as condições ao longo de vastos períodos de tempo e a investigação de materiais biológicos abrigados em seu interior pode fornecer informações sobre ambientes antigos. Para analisar adequadamente esses ecossistemas e extrair informações biológicas significativas de solos e gelo congelados, é necessária a coleta e o processamento adequados das amostras congeladas. Isso é especialmente crítico para análises microbianas e de DNA, uma vez que as comunidades presentes podem ser tão diferentes das modernas. Aqui, é apresentado um protocolo para coletar e descontaminar com sucesso os núcleos congelados. Tanto a ausência das colônias usadas para dopar a superfície externa quanto o DNA exógeno sugerem que descontaminamos com sucesso os núcleos congelados e que os microrganismos detectados eram do material, e não da contaminação da perfuração ou processamento dos núcleos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A criosfera (por exemplo, solos de permafrost, características gelo, neve glacial, firn e gelo) oferece um vislumbre do que tipos de organismos persistiu em condições ambientais do passado. Uma vez que estes substratos pode ser dezenas a centenas de milhares de anos de idade, suas comunidades microbianas, quando preservado congeladas desde a deposição, refletem as condições ambientais antigos. Para analisar adequadamente estes ecossistemas e extrair informação biológica significativa de solos congelados e gelo, coleta adequada e processamento das amostras congeladas é necessário. Isto é de extrema importância como projeções climáticas para o século 21 indicam o potencial para um aquecimento acentuado em regiões árticas e sub-árticas 1. Especificamente, Interior do Alasca e Groenlândia são esperados para aquecer cerca de 5 ° C e 7 ° C, respectivamente em 2100 2,3. Isto é esperado para afetar significativamente o solo e comunidades microbianas aquáticos, e, portanto, relacionadaprocessos biogeoquímicos. As temperaturas mais quentes e regime de precipitação alterados são esperados para iniciar a degradação do permafrost em muitas áreas 2-5 potencialmente levando a uma mais grossa, sazonalmente descongelado (ativo) camada 6,7, o degelo dos solos congelados, ea fusão de corpos de gelo enormes, tais como gelo no solo, cunhas de gelo, e segregação de gelo 8. Isto mudaria drasticamente os atributos biogeoquímicos além da biodiversidade de plantas e animais nestes ecossistemas.

gelo glacial e características de sedimentos permafrost e gelo singenéticos ter aprisionado química e evidência biológica de um ambiente representando o que viveu lá no momento as características formado. Por exemplo, no Interior do Alasca, tanto Illinoisan e Wisconsin permafrost com idades estão presentes e este permafrost em particular fornece os locais únicos que datam de moderno a 150.000 anos antes do presente (YBP) que contêm evidência biológica e geoquímica do impact das mudanças climáticas passadas sobre a biodiversidade. Como resultado, estes sedimentos fornecem um registro da biogeoquímica e da biodiversidade ao longo de muitos milhares de anos. Uma vez que a área tem taxas de sedimentação baixos e nunca foi glaciar, as amostras não perturbadas são acessíveis para recolha e análise, tanto de perfuração verticalmente no perfil do solo ou de perfuração horizontal em túneis. Mais importante ainda, existem extensos registros que, especialmente destacar as características únicas de biogeoquímicos permafrost nessa região 9-14. Especificamente, a aplicação da análise de DNA para estimar presença e extensão da biodiversidade em ambas as amostras de gelo e permafrost existentes e antigas permite a exploração da ligação das condições ambientais antigas e habitat para a ocupação por organismos específicos.

Estudos anteriores identificaram impactos climáticos sobre mamíferos, plantas e microorganismos de amostras datando de 50k YBP 11, 15-19, embora cada estudo utilizou uma differemetodologia nt para recolher e descontaminar as permafrost ou gelo núcleos. Em alguns casos, os núcleos de perfuração foram esterilizados 16, 20-21, embora a metodologia específica não esclarecer se os ácidos nucleicos estranhos, foram igualmente eliminadas a partir das amostras. Em outros estudos, 15 isolados bacterianos (por exemplo, Serratia marcescens), bem como as microesferas fluorescentes 22 foram utilizadas para medir a eficácia de processos de descontaminação.

Este experimento foi parte de um estudo maior investigando comunidades microbianas a partir de amostras de permafrost que datam YBP cerca de 40k. O objectivo específico desta parte do estudo foi para descontaminar com sucesso de gelo e permafrost núcleos. Para nosso conhecimento, nenhuma metodologia tem integrado o uso de soluções concebidas para eliminar os ácidos nucleicos estranhos e nucleases associados a partir da porção exterior dos núcleos congelados. Isto apesar do fato de que estas soluções são commonly usado para descontaminar equipamentos de laboratório para experimentos moleculares.

Uma vez que os núcleos foram descontaminadas, o DNA genómico foi extraído utilizando os protocolos desenvolvidos por Griffiths et al. 23 e TOWE et al. 24, quantificado utilizando um espectrofotómetro, e diluiu-se com água estéril, isenta de ADN para atingir 20 ng por reacção. Bacterianas genes 16S rRNA foram amplificadas com primers 331F e 797R e sonda BacTaq 25 e 16S archaeal genes rRNA foram amplificadas com primers Arch 349F e Arch 806R e a sonda TM Arch 516F 26 sob as seguintes condições: 95 ° C durante 600 segundos seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 60 segundos, e 72 ° C durante 25 seg, com extensão final a 40 ° C durante 30 seg. Todas as reacções foram conduzidas qPCR em duplicado. Os volumes de reacção de 20 ul incluídos 20 ng de ADN, 10 pM de iniciadores, 5 uM de sonda, e 10 ul da mistura de reacção qPCR. normas for qPCR bacteriana e archaea foram preparadas usando ADN genómico de Pseudomonas fluorescens e Halobacterium salinarum, respectivamente. Ambos foram cresceu até à fase log. As contagens foram realizadas e o ADN foi isolado a partir das culturas. O ADN genómico foi quantificada com um espectrofotómetro com o pressuposto de um e seis cópias do gene 16S rRNA por genoma de H. salinarum e P. fluorescens, respectivamente 27-28. número de cópias dos genes de bactérias e archaea foram calculados com base na curva padrão, log-transformada em conta as especificidades desiguais entre tratamentos, e avaliados por análise de variância.

Composição da comunidade foi determinada por sequenciamento do gene 16S rRNA usando células de fluxo e tecnologias de amplificação ponte e analisar as comunidades com insights quantitativos em ecologia microbiana "(QIIME) 29. Para a frente e reverso lê foram unidas e depois sequências foram filtrados, indexado,e representantes de alta qualidade foram selecionados para unidades taxonômicas operacionais (OTU) cessão de novo através de um alinhamento de sequência com uma base de dados de referência. sequências alinhadas foram comparados com um banco de dados de referência separado para atribuição taxonômica. Uma tabela OTU nível filo foi criado para determinar a composição da comunidade em geral.

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Protocolo

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1. Preparação Equipamentos e Permafrost Coleção Núcleo

  1. Preparação de equipamento e coleta de amostra de campo e equipamentos de preservação
    1. Montar trado para coleta de amostras, inserindo o adaptador de unidade no topo do barril e girando a alavanca para travá-lo no lugar. Pin o tubo de adaptador para o adaptador de unidade e fixe o motor no tubo adaptador. Insira os cortadores no barril.
    2. Usar ternos de luz dever, luvas de borracha nitrílica e máscaras para reduzir qualquer contaminação das amostras. Use protetores de ouvido e um capacete de segurança para a segurança ao entrar no túnel do Permafrost (Figura 1).
    3. Entre no túnel e selecione um local para recolher as amostras (Figura 1B).
      Nota: Para a localização da perfuração vertical ou horizontal, seleccionar uma área onde não é conhecida a evidência de que o material é congelado (por exemplo, gelo ou gelo permanente), não há grande sistemas radiculares conhecidas, e não há cascalho conhecida. Deletar tudovivendo material vegetal da área antes de coletar uma amostra. Se a perfuração vertical ou horizontalmente, selecionar uma área que é relativamente plana e acessível com a broca.
    4. Prepara-se uma estação de trabalho por camadas do solo com um material plástico que foi esterilizada com isopropanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e a solução de descontaminação de RNase.
    5. Coloque um diâmetro de 10 centímetros de cloreto de polivinilo (PVC) de corte de tubos em meio longitudinalmente na estação de trabalho para proporcionar uma calha para segurar os núcleos à medida que são removidos a partir do sem-fim. Descontaminar o tubo de PVC com 70% de isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    6. Perto da estação de trabalho, descontaminar o trado por aspersão com 70% isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase. Remover soluções do sem-fim com um wipe.
  2. Gelo e permafrost coleta e armazenamento do núcleo
    1. Escolha de uma área da parede de amostra (ver 1.2.1Nota).
    2. Descontaminar cerca de 10 cm de diâmetro da área de parede congelada esfregando-o com 70% isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    3. Elevar a verruma descontaminado para a área de interesse tal que é perpendicular à área da amostra e começar a perfurar a face feita de a parede (Figura 1C, D).
    4. Remova cuidadosamente a broca da área de coleta de amostras. Desligue a broca do motor e coloque o trado acima do tubo de PVC estéril na estação de trabalho limpa. Cuidadosamente incline trado de tal forma que os núcleos congelados deslizar para fora sobre o tubo de PVC estéril (Figura 1E).
    5. Descontaminar luvas com 70% isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    6. Pegar os núcleos de gelo e permafrost com luvas estéreis e colocá-los em sacos estéreis.
    7. Coloque os núcleos em um quarto mais frio ou frio até que sejam enviados ou processados.
    8. ShPI, os núcleos congeladas usando gelo seco para mantê-las a uma temperatura inferior a 0 ° C.
    9. Imediatamente armazenar os núcleos a -80 ° C.

2. Permafrost and Ice núcleo de processamento

  1. preparação do material
    1. Prepare, folha estéril nucleico ácido livre de pesados ​​de alumínio, prateleiras de metal, vidro, pinças metálicas e lã de vidro por aquecimento em um forno a 450 ° C durante 4 h. Separe estes materiais até ser utilizado.
    2. Esterilizar 95% de etanol e água ultrapura, passando as soluções através de um filtro de 0,22 um.
    3. solução de etanol Armazenar a -20 ° C e água a 4 ° C.
    4. Esterilizar uma régua de plástico por aspersão com etanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e uma solução de ARNase a descontaminação e limpando imediatamente depois de cada solução.
  2. Preparação Cultura bacteriana
    1. Prepare caldo e placas de crescer Serratia marcescens.
      1. Para o caldo, misture 5 g tryptone, 1 g de glucose, 5 g de extracto de levedura, e 1 g de fosfato dibásico de potássio, e em seguida, adicionar água destilada para atingir um L. Para fazer placas, adicionar 15 g de ágar à mistura acima. Para caldo e placas, ajustar o pH a 7 e autoclave a 121 ° C durante 15 min.
    2. Preparar a solução salina de fosfato desbastado 1x (PBS) através da combinação de 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de fosfato dibásico de sódio, e 0,24 g de fosfato monobásico de potássio e adicionando água destilada para atingir 800 ml. Ajustar o pH para 7,4 e adicionando água destilada, para chegar a um L. autoclave a 121 ° C durante 15 min.
    3. Inocular caldo com uma ansa estéril por imersão na S. marcescens cultura que foi previamente armazenado congelado a -80 ° C. Sob condições assépticas, diluído em série da cultura através da adição de 1 ml de cultura a 9 ml de PBS e manualmente inverter a solução. Adicionar 1 ml desta diluição para 9 ml de PBS e inverter manualmente a solução. Repita mais oito vezes até que um Dilu 10 -9ção é atingido.
    4. Espalhe os 10 -6, 10 -7, 10 -8, -9 e 10 soluções em placas de agar com a distribuição de 1 ml de caldo na placa e espalhar com um espalhador de célula. Faça isso em triplicado por diluição. Armazenar a cultura original a 4 ° C.
    5. Incubar as placas a 30 ° C durante 24 h. Contar o número de colónias para calcular o número de células na cultura original. Nota: O número de colónias em cultura original vai depender da taxa de crescimento das bactérias.
    6. Pipetar 250 ul da cultura original para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. Dilui-se a cultura original por adição de um volume suficiente de 1x PBS para se obter aproximadamente 10 9 culas / ml, tal como determinado por contagem de colónias na etapa anterior. Agregar as células num tubo de microcentrífuga por centrifugação a 2500 xg durante 10 min.
      Nota: O volume de PBS 1x irá variar dependendo da taxa de crescimento das bactérias.
    7. Numa biohood estéril, Pipeta fora do caldo e voltar a suspender as células em 1 ml de 1x tampão PBS. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização ou cerca de dois meses.
    8. No dia de processamento, dilui-se a S. marcescens cultura a partir do passo 2.2.7, adicionando 1 ml de S. inicial marcescens cultura para 39 mL de 1x tampão PBS num tubo de centrífuga de 50 ml.
  3. Prepare espaço da sala fria para processamento de núcleo e engrenagem preservação
    1. Antes de refrigeração da câmara fria, paredes limpas, pisos e mesa de metal com uma solução de água sanitária 1%.
    2. Ajustar a temperatura da sala fria para cerca de -11 ° C.
    3. Uma vez que a sala fria atingiu a temperatura desejada, usam ternos leves dever, luvas de borracha nitrílica e máscaras para reduzir qualquer contaminação para o quarto frio e as amostras.
      Nota: Dois indivíduos adequadamente vestidos são necessários para este procedimento.
    4. Traga os materiais estéreis (por exemplo, uma folha de alumínio, prateleiras de metal, vidros, bandeja, S. marcescens cultura e milâmina crotome) e as amostras para a sala fria e coloque sobre a mesa estéril.
  4. Permafrost e processamento núcleo de gelo em uma instalação de sala fria
    1. Coloque um núcleo permafrost em uma folha estéril, nucleico ácido livre de papel alumínio.
    2. Levemente inocular o exterior do núcleo com a cultura diluída de S. marcescens usando um tampão de espuma estéril (Figura 2B).
    3. Coloque o núcleo no rack de metal estéril que fica acima de uma bandeja.
    4. Esterilizar a lâmina de aço micrótomo com etanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e a solução de descontaminação de RNase.
    5. Tem Individual A borracha nitrílica limpo luvas com etanol a 70%, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase e mantenha núcleo em um ângulo de 45 ° acima da bandeja.
    6. Tem Pessoa B raspe cerca de 5 mm do lado de fora de todo o núcleo, incluindo as extremidades, usando a lâmina estéril, enquanto Individual A transforma o núcleo depois de cada raspagem ( Figuras 2C e 3A, B). Limpar a lâmina com etanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e a solução de descontaminação de RNase conforme necessário.
    7. Tem Pessoa B derramar esterilizada por filtração de 95% de etanol sobre o núcleo com cuidado e rapidamente, enquanto Individual A transforma o núcleo como a solução é vertida (Figuras 2D, 3C).
    8. Tem Individual B lavar imediatamente o núcleo com água esterilizada por filtração.
    9. Substitua rack de metal usado na bandeja com um novo rack de metal estéril.
    10. Tem Individual A limpar suas luvas de borracha nitrílica com etanol 70%, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase e mantenha o núcleo em um ângulo de 45 ° acima da bandeja.
    11. Tem Individual B pulverizar todo o núcleo com uma solução de DNA de descontaminação.
    12. Tem Individual B lavar imediatamente o núcleo com água esterilizada por filtração.
    13. Tem Individual B pulverizar todo o núcleo com uma solução de descontaminação RNase.
    14. tem Individual B lavar imediatamente o núcleo com água esterilizada por filtração.
    15. Coloque o núcleo em uma folha estéril de papel alumínio e leve embrulhar.
  5. núcleo externo Thaw
    1. Colocar uma armação de metal estéril sobre um prato de vidro esterilizada num biohood estéril com fluxo laminar.
    2. Colocar duas placas de agar específicos para S. marcescens no prato de vidro abaixo da cremalheira estéril para recolher o líquido a partir do núcleo (Figura 2E).
    3. Coloque o núcleo no rack de metal estéril.
    4. Permitir que cerca de 2-5 mm da superfície exterior do núcleo a descongelar a 23 ° C (em média, isto irá ocorrer dentro de cerca de 10 min). Ligue o núcleo de aproximadamente 90 ° a cada 2 min.
    5. Swab toda a superfície do núcleo usando uma pinça estéril e lã de vidro estéreis e inocular duas placas de ágar específico para S. marcescens por raspagem estes materiais na superfície das placas. Inocular duas novas placas com a cultura original utilizado para lubrificar o exterior donúcleo, que foi exposta às temperaturas baixas da sala fria.
    6. Medir as dimensões exteriores do núcleo cilíndrico descongeladas colocando uma régua estéril perto, mas não tocar o núcleo.
    7. Coloque o núcleo em grande saco estéril e armazená-lo a -80 ° C.
  6. Verifique para o crescimento
    1. Incubar as placas de agar a 23 ° C durante uma semana.
    2. Examine placas de ágar para o crescimento de S. colónias marcescens.
      1. Se não houver colónias visíveis na placa, vá para o passo 2.5.3.
      2. Se colónias aparecem na placa, repita a partir do passo 2.1.1 na secção 2 "Permafrost e processamento núcleo de gelo".
    3. Obter o núcleo do congelador e assepticamente transferi-lo para um saco estéril.
    4. Armazenar o núcleo num saco estéril, a 4 ° C durante cerca de 24-48 h para descongelar todo o núcleo.

3. Obter Subamostra de Ácido Nucleico Extração de gelo Cores e Permafrost

  1. extração de ácidos nucléicos de núcleos de gelo
    1. Misturar o material descongelado a partir do núcleo de gelo agitando suavemente o saco (Figura 2G).
    2. Deite o material descongelado para um recipiente estéril com um filtro de 0,22 um sob vácuo para recolher os microrganismos.
    3. Assepticamente remover o filtro com uma pinça estéril e colocá-lo em um 2 ml talão tubo de cerâmica estéril (1,4 mm).
    4. Armazenar o filtro a -80 ° C.
  2. extração de ácidos nucléicos de núcleos de permafrost
    1. Misturar o material descongelado a partir do núcleo permifrost por amassar suavemente o saco.
    2. Após o permafrost tem sido bem misturada, obter uma subamostra de solo em massa aproximadamente 0,5 g com um scoopula estéril e colocá-lo em um estéril 2 ml tubo de cerâmica talão tampa de rosca tarado (1,4 mm) que fica em pé sobre uma balança.
    3. subsamples armazenar a -80 ° C.
    4. Obter conteúdo de água gravimétrica de amostras.
      1. Medir 10 g do permafrost com um sterile scoopula e coloque em uma lata tarado numa balança. Medir a massa molhada do permafrost e estanho.
      2. Incubar permifrost num forno regulado a 105 ° C durante 24 h. Medir a massa seca de permafrost e estanho.
      3. Calcular o teor de água gravimétrica subtraindo a massa húmida de permifrost por a massa seca do permifrost e dividindo pela massa seca de gelo permanente.
    5. permifrost armazenar a -80 ° C.

4. Extraia Nucleic Acids de permafrost e gelo Cores

  1. preparação do material
    1. Prepare frascos âmbar para manter soluções por tratamento com 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC), incubação O / N a 37 ° C, e autoclavagem.
    2. Preparar tampão 240 mM de solução de fosfato de potássio. Adicionar 2. 5 g de fosfato monobásico de potássio e 38,7 g de fosfato de potsio dibico. Ajustar o volume final para 500 ml por adição de água estéril.
    3. Prepare brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) buf extracçãofer por dissolução de 4,1 g de cloreto de sódio em 80 ml de água e adicionando lentamente 10 g de CTAB, aquecendo e agitando. Ajustar o volume final para 100 ml por adição de água estéril.
    4. Adicionar igual volume de solução de tampão fosfato e tampão CTAB e filtro de esterilização com um filtro de 0,22 um. Cobrir garrafa com folha de alumínio e armazenar a RT.
    5. Preparar solução 1,6 M de cloreto de sódio (NaCl) pela combinação de 9,35 g de NaCl e 100 ml de água estéril. Adiciona-se 10 g de polietileno glicol 8000 para a solução e filtra-se esterilizar de NaCl 1,6 M. Armazenar a 4 ° C.
  2. Extracção de ácido nucleico de acordo com uma versão modificada de Griffiths et al. 22 e TOWE et al. 23
    1. Usar ternos de luz dever, luvas de borracha nitrílica, e máscaras. espaço de laboratório limpo e pipetas com etanol a 70%, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    2. Remover subamostra (filtro de núcleo de gelo ou amostra de solo permafrost) em 2 ml talão de cerâmica parafuso-catubo de p de -80 ° C congelador e descongelar à temperatura ambiente.
    3. Adicionar 0,5 ml de brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) tampão de extração e vortex brevemente.
    4. Adicionar 0,5 ml de álcool-fenol-clorofórmio isoamílico (25: 24: 1) (pH 8) e agitar tubos horizontalmente durante 10 minutos utilizando uma placa de painel plano em um agitador.
    5. Seguindo-grânulo batimento, tubos de centrífuga a 16.100 xg durante 5 min a 4 ° C.
    6. Remover a camada aquosa para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e misturar com um volume igual de clorofórmio-álcool isoamílico (24: 1). Centrifuga-se a 16100 xg durante 5 min a 4 ° C.
    7. Remover a camada aquosa para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e adicionar dois volumes de 30% de polietileno glicol 8.000 e 1,6 M de NaCl. Incubar durante 2 horas a 4 ° C.
    8. Centrifuga-se a 16100 xg durante 10 min a 4 ° C.
    9. Lave o peletizado de ácido nucleico com cerca de 500 mL de gelo-etanol frio a 70% e centrifugar a 16100 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. Ar sedimento seco num biohood estéril durante 2 hr. Ressuspender em 50 ul de tampão TE de DNase / RNase-free (pH 8,0). ADN está pronto para aplicações a jusante, tais como PCR e qPCR.
    11. Determinar a concentração de ADN com um espectrofotómetro.
    12. Dilui-se o ADN com água estéril, isenta de ADN para atingir 20 ng por reacção.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método apresentado poderia ser utilizado para descontaminar amostras congeladas recolhidas de vários ambientes cryosphere, a partir de gelo glacial para permafrost. Aqui, apresentamos os dados especificamente recolhidos a partir de amostras de gelo e permafrost coletados a partir da Pesquisa de Engenharia e Centro de Desenvolvimento - Cold Regiões Laboratório de Pesquisa e Engenharia (ERDC-CRREL) Permafrost túnel localizado na Fox, AK (Figura 1A e 1B)....

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Embora a taxa recuperado pode não representar a comunidade histórica completa, aqueles recuperados a partir de análise de amostras de gelo e permafrost glacial pode render valiosas informações históricas sobre seleccionar períodos de tempo 15-16. Por exemplo, a informação biológica significativa foi elaborado a partir de estudos de gelo que investigam atividade anaeróbica no gelo da Groenlândia 20

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Engenheiros do Exército dos EUA, Escritório do Programa de Pesquisa Básica. A permissão para publicar essas informações foi concedida pelo Chefe de Engenheiros.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AugerSnow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% IsopropanolWalmart551116880
95% Ethyl Alcohol (desnaturado) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
Solução de descontaminação de DNA, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
Solução de descontaminação de RNase, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
Light Duty SuitsKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Luvas de NitriloFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Máscaras AntiviraisCurad, WalgreensCUR3845
Sacos de Amostras Estéreis Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Lâmina de Micrótomo de Aço B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Rack de MetalFabricado na CRREL, Hanover, NH
TrayHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
Folha de AlumínioWestern Plastics, Temecula, CA
Garrafa de 500 ml com 0.22  μ m FiltroCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Capuz de BiossegurançaNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Placa de PetriFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TriptonaAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlicoseFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Extrato de leveduraFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Fosfato dipotássicoJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Sparks, MD214530
NanoDrop 2000 EspectrofotômetroUV VisThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianápolis, IN
em>Halobacterium salinarumColeção de Cultura de Tipo Americano (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescensColeção de Cultura de Tipo Americano (ATCC), Manassas, VA
Kit de isolamento de DNA microbianoMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Proteção para os ouvidosElvexEP-201
Capacete
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Lã de vidroPyrex430330
Régua
Lata de pesagem Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Cloreto de sódioSigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Cloreto de potássioJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Fosfato de potássio, monobásicoJT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Fosfato de potássio, dibásicoJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Fosfato de sódio dibásico, anidroFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
Tubos de centrífuga de 50 mlCorning, Corning, NY4558
Tubos de microcentrífuga de 2 mlMoBio Laboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
Tubos de Esferas de Cerâmica de 2 ml (1.4  mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Dietilpirocarbonato (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
HexadeciltrimetilamôniaAcros Organics, NJ22716-5000
Polietilenoglicol 8000 Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Álcool fenol-clorofórmio-isoamílico (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
CentrífugaEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Álcool clorofórmio-isoamílico (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetasRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 e 1,000 µ l pipetas
Pontas de pipetaRainin, Woburn, MARainin LTS pré-esterilizadas, baixa retenção, pontas filtradas, 10, 20, 200, 1.000  µ l
VortexorScientific Industries, Bohemia, NYG-560
MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Clear BottleCorning, Corning, NYC1395500
Amber BottleCorning, Corning, NYC5135250
Filtros de Topo de Garrafa, 0.22  µ mCorning, Corning, NY430513
Seringa de 60 mlBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJBD 309653
Millex Filtros de seringa, 0,22 μ mEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
70% de etanolFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500diluído e esterilizado por filtro
Isotemp 100 L FornoFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Espalhador de célulasFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Alças de inoculação descartáveisFisher Científico, Pittsburgh, PA22-363-602
< Adaptador de Vórtice

Referências

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