Verwijdering van exogene materialen uit het buitenste gedeelte van Frozen Cores tot de Oude Biologische Gemeenschappen koesterde Inside Onderzoek
Summary
De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Een protocol wordt gepresenteerd te verzamelen en te ontsmetten permafrost kernen van de bodem en ijs. De afwezigheid van exogeen DNA kolonies en suggereren dat microorganismen gedetecteerd vertegenwoordigt de theorie en minder contaminatie door boren of verwerking.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
De cryosfeer (bijv permafrost bodems, ijs eigenschappen, ijzige sneeuw, firn en ijs) biedt een kijkje in welke soorten organismen bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Aangezien deze substraten tientallen kan zijn om honderden duizenden jaren oud, hun microbiële gemeenschappen, wanneer bewaard gebleven bevroren sinds de afzetting, weerspiegelen de oude milieu-omstandigheden. Om adequaat te analyseren deze ecosystemen en extract zinvolle biologische informatie van bevroren bodems en ijs, een goede inzameling en verwerking van de bevroren monsters nodig. Dit is van groot belang als het klimaat prognoses voor de 21e eeuw geven het potentieel voor een uitgesproken opwarming in arctische en sub-arctische gebieden 1. In het bijzonder, Interior Alaska en Groenland zullen naar verwachting op te warmen ongeveer 5 ° C en 7 ° C, respectievelijk in 2100 2,3. Dit zal naar verwachting grote invloed bodem en het aquatische microbiële gemeenschappen, en dus, aanverwantebiogeochemische processen. De warmere temperaturen en veranderde neerslag regime wordt verwacht dat permafrost afbraak in veel gebieden 2-5 kan leiden tot een dikkere, seizoen ontdooid (actieve) laag 6,7, het ontdooien van bevroren bodems, en het smelten van de massale ijs organen zoals initiëren gemalen ijs, ijs wiggen, en segregatie ijs 8. Dat zou dramatisch de biogeochemische attributen veranderen in aanvulling op de biodiversiteit van planten en dieren in deze ecosystemen.
Gletsjerijs en syngenetische permafrost sediment en ijs functies zijn gevangen chemische en biologische bewijs van een omgeving die wat daar woonde op het moment dat de functies gevormd. Bijvoorbeeld, in Binnenlands Alaska, zowel Illinoisan en Wisconsin jaar permafrost aanwezig zijn en deze permafrost in het bijzonder biedt unieke locaties daterend van modern tot 150.000 jaar voordat de huidige (YBP), die de biologische en geochemische bewijs van de Impa bevattenct van vroegere klimaatveranderingen op de biodiversiteit. Als gevolg van deze sedimenten geven een overzicht van de biogeochemie en de biodiversiteit gedurende vele duizenden jaren. Omdat het gebied heeft een lage sedimentatie tarieven en is nooit glaciated, ongestoorde monsters zijn toegankelijk voor het verzamelen en analyseren, ofwel boren verticaal in het bodemprofiel of boren horizontaal in tunnels. Wat nog belangrijker is, uitgebreide verslagen bestaan die vooral wijzen op de unieke biogeochemische kenmerken van permafrost in deze regio 9-14. Met name de toepassing van DNA-onderzoek om de aanwezigheid en de omvang van de biodiversiteit te schatten, zowel in bestaande en oude ijs en permafrost samples maakt verkenning van de koppeling van de oude milieu-omstandigheden en de habitat aan bezetting door specifieke organismen.
Eerdere studies hebben klimatologische effecten op zoogdieren, planten en micro-organismen uit monsters dating tot 50k YBP 11, 15-19 geïdentificeerd, hoewel elk onderzoek gebruik gemaakt van een different methodologie voor het verzamelen en ontsmetten van de permafrost of ijskernen. In sommige gevallen werden de boorkernen gesteriliseerde 16, 20-21, hoewel de specifieke methodologie niet duidelijk of vreemde nucleïnezuren ook werden uit de monsters. In andere studies, bacteriële isolaten 15 (bijvoorbeeld Serratia marcescens) en fluorescente microsferen 22 zijn gebruikt om de effectiviteit van zuiveringsmethoden meten.
Dit experiment was onderdeel van een groter onderzoek naar microbiële gemeenschappen van permafrost monsters die teruggaat tot ongeveer 40k YBP. De specifieke doelstelling van dit deel van het onderzoek was om met succes te ontsmetten ijs en permafrost kernen. Voor zover wij weten, is er geen methode het gebruik van oplossingen volgens vreemde nucleïnezuren en geassocieerde nucleasen verwijderen uit het buitenste gedeelte van de bevroren kernen geïntegreerd. Dit ondanks het feit dat deze oplossingen commonly gebruikt om laboratoriumapparatuur decontamineren voor moleculaire experimenten.
Zodra de kernen werden gedecontamineerd, werd genomisch DNA geëxtraheerd met behulp van protocollen ontwikkeld door Griffiths et al. 23 en towe et al. 24, gekwantificeerd onder toepassing van een spectrofotometer en verdund met steriel, DNA-vrij water tot 20 ng per reactie te bereiken. Bacteriële 16S rRNA genen werden geamplificeerd met primers 331F en 797R en sonde BacTaq 25 en Archaea 16S rRNA genen werden geamplificeerd met primers Arch 349F en Arch 806R en sonde TM Arch 516F 26 onder de volgende voorwaarden: 95 ° C gedurende 600 seconden, gevolgd door 45 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 57 ° C gedurende 60 sec en 72 ° C gedurende 25 sec met een laatste verlenging bij 40 ° C gedurende 30 sec. Alle qPCR reacties werden uitgevoerd in tweevoud. De 20 pi reactievolume inbegrepen 20 ng DNA, 10 uM primers, 5 uM van de sonde en 10 pl van het reactiemengsel qPCR. normen for bacteriën en archaea qPCR werden bereid met behulp van genoom DNA van Pseudomonas fluorescens pt Halobacterium Salinarum, respectievelijk. Beiden werden gekweekt tot fase in te loggen. Plaattellingen uitgevoerd en DNA werd geïsoleerd uit de kweken. Genoom DNA werd gekwantificeerd met een spectrofotometer met de aanname van één en zes exemplaren van de 16S rRNA gen per genoom voor H. Salinarum pt P. fluorescens, respectievelijk 27-28. Kopieaantallen van de bacteriën en archaea genen werden berekend op basis van de standaardcurve, log-getransformeerde om rekening te houden ongelijke verschillen tussen behandelingen, en beoordeeld door ANOVA.
Community samenstelling werd bepaald door het sequencen van het 16S rRNA-gen met behulp van stroom cellen en de brug versterking technologieën en analyseren van de gemeenschappen 'kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie' (QIIME) 29. Vooruit en achteruit leest werden samengevoegd en vervolgens sequenties werden gefilterd, geïndexeerd,en vertegenwoordigers van hoge kwaliteit werden geselecteerd voor de novo operationele taxonomische eenheden (OTU) toewijzing door middel van sequentie-uitlijning met een referentie-database. Gealigneerde sequenties werden vergeleken met een afzonderlijke referentiedatabank voor taxonomische opdracht. Een phylum niveau OTU tafel werd opgericht om de algemene gemeenschap samenstelling te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Hoewel de herstelde taxa de complete historische gemeenschap niet mogen vertegenwoordigen, kunnen die hersteld van de analyse van gletsjerijs en permafrost monsters waardevolle historische informatie over select perioden 15-16 opleveren. Zo heeft zinvolle biologische gegevens zijn ontleend aan ijs onderzoeken naar anaërobe activiteit in de Groenlandse ijskap 20 en permafrost studies onderzoeken…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
Referências
- Solomon, S., et al. . Climate Change 2007: The Physical Science Basis. , (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. 29, 1125-1130 (2008).
- Pachauri, R. K., Meyer, L. A. . Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska’s forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -. L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. . Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , (1967).
- Sellmann, P. V. . Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
