La eliminación de materiales exógenos de la parte exterior de congelados Núcleos para Investigar la antigua comunidades biológicas albergaba el interior
Summary
La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. Un protocolo se presentará a recoger y descontaminar los núcleos de permafrost de suelos y hielo. La ausencia de colonias exógenos y el ADN sugiere que los microorganismos detectados representan el material, en lugar de la contaminación de la perforación o de procesamiento.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
La criosfera (por ejemplo, los suelos de permafrost, características hielo, nieve glacial, firn y hielo) ofrece una visión de qué tipos de organismos persistido en las condiciones ambientales del pasado. Dado que estos sustratos pueden ser de decenas a cientos de miles de años de antigüedad, sus comunidades microbianas, cuando se conservan congeladas desde el depósito, reflejar las condiciones ambientales antiguos. Para analizar adecuadamente estos ecosistemas y extraer información biológica significativa de los suelos congelados y el hielo, la correcta recogida y procesamiento de las muestras congeladas es necesario. Esto es de suma importancia que las proyecciones climáticas para el siglo 21 indican la posibilidad de un calentamiento pronunciado en las regiones árticas y subárticas 1. En concreto, se espera que Alaska interior y Groenlandia para calentar aproximadamente a 5 ° C y 7 ° C, respectivamente, para el año 2100 2,3. Se espera que un impacto significativo en el suelo y las comunidades microbianas acuáticos y, por tanto, relacionadaprocesos biogeoquímicos. Se espera que las temperaturas más cálidas y alteración del régimen de precipitación para iniciar la degradación del permafrost en muchas áreas 2-5 que podría dar lugar a una más gruesa, descongelado estacionalmente (activo) capa 6,7, el deshielo de los suelos congelados, y el derretimiento del hielo cuerpos masivos como hielo del suelo, cuñas de hielo, y la segregación de hielo 8. Esto cambiaría drásticamente los atributos biogeoquímicos, además de la biodiversidad de plantas y animales en estos ecosistemas.
El hielo glaciar y las características de los sedimentos del permafrost y hielo syngenetic han atrapado evidencia biológica de un entorno que representa lo que vivía allí en el momento de las características químicas y forman. Por ejemplo, en Alaska interior, tanto Illinoisan y Wisconsin permafrost de edades están presentes, y dicha permafrost, en particular, ofrece lugares únicos que datan de lo moderno a 150.000 años antes del presente (aap) que contienen evidencia biológica y geoquímica de la IMPAct de los cambios climáticos pasados en la biodiversidad. Como resultado, estos sedimentos proporcionan un registro de la biogeoquímica y la biodiversidad durante muchos miles de años. Puesto que el área tiene bajas tasas de sedimentación y nunca se ha glaciación, muestras inalteradas son accesibles para la recogida y el análisis, ya sea de perforación vertical en el perfil del suelo o de perforación horizontal en los túneles. Más importante aún, existen extensos registros que, sobre todo resaltar las características únicas de permafrost biogeoquímicos en esta región 9-14. En concreto, la aplicación del análisis de ADN para estimar la presencia y extensión de la biodiversidad en las dos muestras de hielo y permafrost existentes y antiguas permite la exploración de la conexión entre las condiciones ambientales y de hábitat antiguos de ocupación por parte de organismos específicos.
Estudios previos han identificado los impactos climáticos en mamíferos, plantas y microorganismos de muestras que datan de 50k aap 11, 15-19, aunque cada estudio utilizó una diferent metodología para recolectar y descontaminar el permafrost o hielo núcleos. En algunos casos, los núcleos de perforación se esterilizaron 16, 20-21, aunque la metodología específica no aclaró si los ácidos nucleicos extranjeros también fueron eliminados de las muestras. En otros estudios, aislamientos bacterianos 15 (por ejemplo, Serratia marcescens), así como microesferas fluorescentes 22 se han utilizado para medir la eficacia de los procedimientos de descontaminación.
Este experimento fue parte de un estudio más amplio que investiga las comunidades microbianas de muestras de permafrost que datan de aproximadamente 40k aap. El objetivo específico de esta parte del estudio era para descontaminar éxito de hielo y permafrost núcleos. Hasta donde sabemos, no existe una metodología ha integrado el uso de soluciones diseñadas para eliminar los ácidos nucleicos extraños y nucleasas asociados de la parte exterior de los núcleos congelados. Esto a pesar del hecho de que estas soluciones son commonly utilizado para descontaminar el equipo de laboratorio para experimentos moleculares.
Una vez que se descontaminan los núcleos, se extrajo ADN genómico utilizando los protocolos desarrollados por Griffiths et. Al 23 y Töwe et al. 24, cuantificado usando un espectrofotómetro, y se diluyó con agua estéril, libre de ADN para lograr 20 ng por reacción. Bacterianas 16S rRNA genes se amplificaron con cebadores 331F y 797R y la sonda BacTaq 25 y 16S arqueas rRNA genes se amplificaron con cebadores Arco 349F y Arco 806R y sondear TM Arco 516F 26 bajo las siguientes condiciones: 95 ° C durante 600 segundos seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 60 seg, y 72 ° C durante 25 seg con extensión final a 40 ° C durante 30 seg. Todas las reacciones de qPCR se llevaron a cabo por duplicado. Los volúmenes de reacción de 20 l incluyeron 20 ng de DNA, 10 mM de los cebadores, 5 mM de la sonda, y 10 l de la mezcla de reacción qPCR. normas for qPCR bacteriano y archaeal se prepararon utilizando el ADN genómico de Pseudomonas fluorescens y salinarum Halobacterium, respectivamente. Ambos fueron cultivadas hasta la fase logarítmica. Los recuentos de placas se llevaron a cabo y se aisló el ADN de los cultivos. El ADN genómico se cuantificó con un espectrofotómetro con la suposición de uno y seis copias del gen 16S rRNA por genoma de H. salinarum y P. fluorescens, respectivamente 27-28. número de copias de los genes bacterianos y archaeal se calcularon sobre la base de la curva estándar, log-transformados para dar cuenta de desigualdad de las diferencias entre los tratamientos, y se evaluaron mediante ANOVA.
Composición de la comunidad se determinó mediante la secuenciación del gen 16S rRNA utilizando células de flujo y las tecnologías de amplificación de puentes y el análisis de las comunidades con las ideas 'cuantitativos en la ecología microbiana' (QIIME) 29. Hacia adelante y hacia atrás dice estaban unidas entre sí y luego secuencias se filtraron, se indexan,y se seleccionaron los representantes de alta calidad para la asignación de novo unidades taxonómicas operacionales (OTU) a través de la alineación de secuencias con una base de datos de referencia. Alineado secuencias se compararon con una base de datos de referencia independiente para la asignación taxonómica. Una tabla OTU nivel phylum fue creado para determinar la composición de la comunidad en general.
Protocol
Representative Results
Discussion
La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. A pesar de los taxones recuperado puede no representar la comunidad histórica completa, los recuperados a partir del análisis de las muestras de hielo y glaciares de permafrost es posible obtener valiosa información histórica acerca seleccione un intervalo de tiempo de 15-16. Por ejemplo, la información biológica significativa ha sido elaborado a partir de estudios que investigan la activi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
Referências
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