Screening for Funksjonell Non-koding genetiske varianter Bruke Elektro Mobility Skift Assay (EMSA) og DNA-affinitet Nedbør analyse (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Sekvensering og genotyping baserte studier, inkludert Genome-Wide Association Studies (GWAS), kandidat locus studier, og dyp-sekvense studier har identifisert mange genetiske varianter som er statistisk assosiert med en sykdom, trekk, eller fenotype. I motsetning til tidligere prediksjoner, er de fleste av disse variantene (85-93%) lokalisert i ikke-kodende regioner og endrer ikke aminosyresekvensen til proteiner ^1,2. Tolking av funksjonen av disse ikke-kodende varianter og å bestemme de biologiske mekanismer som forbinder dem til den tilhørende sykdom, har egenskap, eller fenotype vist seg vanskelig ^3-6. Vi har utviklet en generell strategi for å identifisere de molekylære mekanismene som lenker varianter til en viktig mellom fenotype – genuttrykk. Denne rørledningen er spesielt utviklet for å identifisere modulering av TF bindende av genetiske varianter. Denne strategien kombinerer beregnings tilnærminger og molekylærbiologiske teknikker som mål å forutsibiologiske effekter av kandidat varianter i silico og bekrefte disse spådommene empirisk (figur 1).

Figur 1:.. Strategisk tilnærming for analyse av ikke-kodende genetiske varianter trinn som ikke er inkludert i detaljert protokoll i forbindelse med dette manuskriptet er skyggelagt i grått Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I mange tilfeller er det viktig å begynne med å utvide listen over varianter for å inkludere alle de i høy linkage-ulikevekt (LD) med hver statistisk tilhørende variant. LD er et mål på ikke-tilfeldig forening av alleler ved to forskjellige kromosomale stillinger, som kan måles ved R ^{2 7. R2} er et mål på linKage ulikevekt mellom to varianter, med en r ² = 1 betegner perfekt kobling mellom to varianter. Alleler i høy LD er funnet å co-skille på kromosomet over forfedrenes populasjoner. Nåværende genotyping arrays omfatter ikke alle kjente varianter i det menneskelige genom. I stedet, de utnytte LD innenfor det menneskelige genom, og inkluderer en undergruppe av de kjente variantene som fungerer som stedfortredere for andre varianter innenfor en bestemt region av LD ^8. Således kan en variant uten noe biologisk konsekvens være assosiert med en spesiell sykdom fordi det er i LD med den kausale variant-varianten med en meningsfull biologisk virkning. Prosedyremessig anbefales det å konvertere den nyeste utgaven av 1000 genomer projisere ⁹ variant samtalefiler (vcf) i binærfiler som er kompatible med plink ^10,11, en ​​åpen kildekode-verktøy for hele genomet forening analyse. Deretter alle andre genetiske varianter med LD r ^2> 0,8 med hver inngang genetisk vaRiant kan identifiseres som kandidater. Det er viktig å bruke riktig referansegruppen for dette trinn for eksempel hvis en variant ble identifisert i fagene europeisk opphav, data fra personer av samme herkomst bør brukes for LD ekspansjon.

LD ekspansjon resulterer ofte i en rekke kandidat varianter, og det er sannsynlig at bare en liten brøkdel av disse bidrar til sykdom mekanisme. Ofte er det umulig å eksperimentelt undersøke hver av disse variantene individuelt. Det er derfor nyttig å utnytte de tusenvis av offentlig tilgjengelige funksjonell genomikk datasett som et filter for å prioritere varianter. For eksempel har KODE konsortiet ¹² utført tusenvis av chip-seq eksperimenter som beskriver binding av TFS og co-faktorer, og histone karakterer i et bredt spekter av sammenhenger, sammen med kromatin tilgjengelighets data fra teknologier som DNase-seq ^13, ATAC -seq ^14, og FAIRE-seq ^15. Databases og webservere som UCSC Genome Browser ^16, Roadmap Epigenomics ^17, Blueprint epigenome ^18, Cistrome ^19, og tilordne ²⁰ gir gratis tilgang til data som produseres av disse og andre eksperimentelle teknikker over et bredt spekter av celletyper og vilkår. Når det er for mange varianter å undersøke eksperimentelt, kan disse dataene brukes til å prioritere de som ligger innenfor sannsynlig regulatoriske regioner i relevante celle- og vevstyper. Videre, i tilfeller der en variant er innenfor en chip-seq topp for et bestemt protein, kan disse dataene gir potensielle kunder med hensyn til spesifikke TF (e) eller co-faktorer som bindende kan påvirke.

Deretter blir de resulterende prioritert variantene vist eksperimentelt å validere spådd genotype-avhengige proteinbinding ved hjelp av EMSA ^21,22. EMSA måler endringen i migreringen av oligo på en ikke-reduserende TBE gel. Fluorescensmerkede oligo inkuberes med denatom lysat, og binding av nukleære faktorer vil retardere bevegelsen av oligo på gelen. På denne måte oligo som har bundet flere nukleære faktorer vil presentere som en sterkere fluorescerende signal på skanning. Spesielt, har EMSA ikke krever spådommer om spesifikke proteiner som binding vil bli berørt.

Når varianter er identifisert som befinner seg innenfor forutsagte regulatoriske områder og er i stand til differensielt bindende nukleære faktorer, blir beregningsmetoder anvendt for å forutsi den aktuelle TF (e) hvis binding de kan påvirke. Vi foretrekker å bruke cis-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, UniProbe ^26, og Jaspar ^27. Når kandidaten TFS er identifisert, kan disse spådommene være spesielt testet ved hjelp av antistoffer mot disse TFS (EMSA-supershifts og DAPA-Westerns). En EMSA-supershift involverer tilsetning av et TF-spesifikt antistoff til det nukleære lysatet og oligo. Et positivt resultat i en EMSA-supershift er represented som en ytterligere forskyvning i EMSA band, eller et tap av bandet (anmeldt i referanse ^28). I den komplementære DAPA, er en 5'-biotinylert oligo duplex inneholder variant og 20 basepar flankerer nukleotider inkubert med atom lysat fra relevant celletype (r) for å fange opp eventuelle atom faktorer spesifikt binde oligos. Oligo duplex-nukleær faktor komplekset er immobilisert streptavidin av mikroperler i en magnetisk kolonne. De bundet kjernefysiske faktorer samles direkte gjennom eluering ^{29,48 -kan.} Bindings forutsigelser kan deretter bli vurdert av en Western blot ved anvendelse av antistoffer som er spesifikke for proteinet. I tilfeller der det er ingen åpenbare forutsigelser, eller for mange spådommer, de elueringer fra variant pull-downs av DAPA eksperimenter kan sendes til en proteomikk kjerne for å identifisere kandidat TFS hjelp massespektrometri, som senere kan bli validert ved hjelp av disse tidligere beskrevet metoder.

I det gjenværende av article er detaljert protokoll for EMSA og DAPA analyse av genetiske varianter forutsatt.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsninger og reagenser Bestille tilpassede DNA oligonukleotid prober for bruk i EMSA og DAPA. For å redusere ikke-spesifikk proteinbinding, utforme korte oligonukleotider (mellom 35-45 basepar (bp) i lengde) 30, og plassere den varianten av interesse direkte i midten flankert av sin 17 bp endogent genomisk sekvens. For EMSA oligonukleotider, legge til en 5 'fluorophore. For DAPA oligonukleotider, legge til en 5 'biotin tag. Bestille både den forstand…

Representative Results

I denne delen er representative resultatene av hva du kan forvente gitt når du utfører en EMSA eller DAPA, og variasjon med hensyn til kvaliteten på lysat er preget. For eksempel har det blitt foreslått at frysing og tining proteinprøver flere ganger kan resultere i denaturering. For å undersøke reproduserbarheten av EMSA analyse i forbindelse med disse "fryse-tine" sykluser, ble to 35 bp oligonukleotider forskjellige ved en genetisk variant inkubert med et enkelt parti …

Discussion

Selv om fremskritt i sekvensering og genotyping teknologi har kraftig forbedret vår evne til å identifisere genetiske varianter assosiert med sykdom, er vår evne til å forstå de funksjonelle mekanismer som påvirkes av disse variantene lagging. En hovedkilde til problemet er at mange sykdomsassosierte variantene er lokalisert i n on-kodende regioner av genomet, som sannsynligvis påvirke vanskeligere å forutsi mekanismene som kontrollerer genekspresjon. Her presenterer vi en protokoll basert på EMSA og DAPA…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES