Tissue Engineering ved Intrinsic vaskularisering i en<em> I Vivo</em> Tissue Engineering Chamber

Summary

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Abstract

I rekonstruktiv kirurgi, er det et klinisk behov for et alternativ til dagens metoder for autolog rekonstruksjon som er komplisert, kostbar og handel en defekt for en annen. Tissue engineering holder løftet om å ta opp denne økende etterspørselen. Men de fleste tissue engineering strategier klarer å generere stabile og funksjonelle vev erstatter på grunn av dårlig vaskularisering. Artikkelen omhandler en in vivo-vevet teknikk kammer modell av indre vaskularisering hvor en perfunderes arterie og en vene, enten som en arteriovenøs sløyfe eller et gjennomstrømnings pedicle konfigurasjon er rettet inne i et hult kammer som er beskyttet. I dette kammer-baserte systemet oppstår angiogen spiring fra de arteriovenøse fartøy og dette systemet tiltrekker iskemisk og inflammatorisk drevet endogene cellemigrering som gradvis fyller kammeret plass med fibro-vaskulært vev. Eksogent celle / matriks implantering på det tidspunkt kammeret konstruksjon forbedrer celle surVival og bestemmer spesifisiteten av de konstruerte vev som utvikler seg. Våre undersøkelser har vist at dette kammer modellen kan med hell generere forskjellige vev, slik som fett, hjertemuskel, lever og andre. Imidlertid er modifikasjoner og forbedringer som kreves for å sikre målvevet dannelse er konsekvent og reproduserbar. Denne artikkelen beskriver en standardisert protokoll for fremstilling av to forskjellige vaskulariserte vevsteknologi kammer modeller in vivo.

Introduction

Fabrikere funksjonell vaskularisert vev ved hjelp av en tissue engineering tilnærming er en voksende paradigme i regenerativ medisin. ^1,2 Mange måter å konstruere nye og friske vevet for utskifting av skadet vev eller defekte organer har blitt utviklet, ^3-6 eksperimentelt i små dyremodeller med lovende klinisk potensial. ^7,8 er imidlertid fortsatt vaskularisering en av de store utfordringene for tissue engineering begrenser dens potensial til å vokse vev av klinisk relevant størrelse. ⁹

Dagens tilnærminger til vascularize vev følge enten en ytre vei hvor nye fartøyene vokse fra mottakeren karsengen og invadere hele implanterte vev konstruerer ¹⁰ eller en iboende vaskularisering sti der blodkar vokser og utvides i takt med den nylig utvikle vev. ¹¹ extrinsic tilnærming tradisjonelt innebærer seeding celler på et stillasin vitro og implantere hele konstruksjonen i den levende dyr med forventning om at næringsstoffer, tidligere levert av dyrkingsmedier, vil bli hentet fra sirkulasjonen. ^12,13 Konseptet er forenklede som vaskulær innvekst er for treg og bare svært tynne implantater (< 1-2 mm tykk) vil være levedyktig. Gir næring og oksygen ved hjelp av en tilstrekkelig og rask vaskularisering er kjernen i enhver vellykket forsøk på å vokse mer komplekse og større vev-konstruert erstatter som bein, muskler, fett og solide organer. ^14,15 Intrinsic vaskularisering tilbyr muligheter for større konstruksjoner for å utvikle ved progressiv vev vekst i samsvar med sin voksende blodtilførsel. En design er in vivo implantering i et kammer av en vaskulær pedicle med eller uten en celle seeded stillaset. ^5,6 Dette har banet vei for nye prosedyrer for generering av tykkere bunn vaskularisert vev. ^16,17 </ P>

Flere nylig, strategier har blitt utviklet for å forhånds vascularize vev grafts, før implantasjon. Disse innlemmet blodårenett som mål å inosculate med verts skip ved implantasjon som åpner for rask levering av et komplett blodtilførsel for å bedre overlevelse av alle deler av et transplantert tykk vev pode. ¹⁸

Vi var pionerer en in vivo vaskularisert tissue engineering modell i små dyr som innebærer en subkutant implantert halvstiv lukket kammer som inneholder en gjennomstrømmet vaskulær pedicle og celleholdige biomaterialer. Kammeret danner en iskemisk miljø som stimulerer angiogen spiring fra de implanterte fartøyene. ³ vaskulær pedicle kan enten være et rekonstruert arteriovenøs løkke eller et intakt gjennomstrømnings arterie og vene. ^3-6,19 Denne vaskulære pedicle spirer en fungerende og omfattende arterio -capillary-venøs nettverk som kobler på både kunsteriole og venøs slutter med vaskulær pedicle. ^3,20 Videre rundt hul støtte kammer beskytter utvikle vev fra potensielt deformeres mekaniske krefter og forlenger iskemisk stasjonen for å forbedre vaskularisering. ^3,21,22 Dersom fartøyet stilken er rett og slett implantert inn normalt vev og ikke inne i beskyttet område av kammeret, opphører angiogene spirende langs den samme tidslinje som en normal sår og ingen ny vevet vil samle seg rundt stilken. Etterforskerne har brukt denne in vivo-konfigurasjon for å produsere tredimensjonale funksjonelle vaskularisert vev konstruksjoner med støttende blodkar og klinisk relevant størrelse. ^4,23 Videre utviklet vaskularisert vev konstruksjoner med sin intakt vaskulær pedicle kan høstes for etterfølgende transplantasjon på skadestedet . ^24,25 En mer klinisk mulig scenario ville være å skape kammeret på definitive stedet for gjenoppbygging such som brystet. Således kunne denne de novo vevsteknologi tilnærming har klinisk potensiale for å tilveiebringe en ny kilde av funksjonell målvevet for rekonstruktiv kirurgi. ^26-28

Følgende protokoll vil gi en generell veiledning for å konstruere en in vivo-vaskularisert vev teknikk kammer i rotte, som kan tilpasses i forskjellige dyremodeller, og som anvendes for å undersøke de innviklede prosesser av angiogenese, matriksproduksjon, cellulær migrasjon og og differensiering.

Protocol

Protokollene er beskrevet her har blitt godkjent av dyreetikk Committee of St. Vincent Hospital Melbourne, Australia, og ble utført under streng overholdelse av australske National Health and Medical Forskningsrådets føringer. MERK: To kammer protokoller er beskrevet nedenfor. De to forskjellige modeller og deres spesifikke kammer utførelser er illustrert i figur 1. Kammeret (1) er fremstilt av polykarbonat (for rotte arteriovenøs løkke kammer modell). Det er sylindrisk med en innvendig diameter på 13 mm og h…

Representative Results

Den mikro opprettelse av vev konstruksjons kamre ble utført som beskrevet i protokollen ovenfor. Vev som genereres inne i kamrene kan undersøkes histologisk som beskrevet i protokollen trinn 3. Ulike typer vev har blitt konstruert ved hjelp av in vivo-vaskularisert kammer (figur 2). Disse inkluderer hjertevevet med neonatale rotte kardiomyocytter (figur 2A), muskelvevet med rotte-skjelett myoblaster (figur 2B), og fettvev med …

Discussion

Prosjektering av mikrosirkulasjonen er for tiden under etterforskning i hovedsak gjennom to tilnærminger. Den første innebærer å utvikle et høyt sammenkoplet vaskulære nettverk innenfor konstruksjonen in vitro, slik at når implantert, kapillærer fra verts karsengen kontakt med de av den transplanterte konstruere gjennom en prosess som kalles inosculation, og dermed sikre levering av næringsstoffer ikke bare til periferien, men også til kjernen. ^21,32,33 Dette kalles pre-vaskularisering. Den…

Materials

1 15 Blade Scalpel	Braun	BB515
1 Toothed Adson Forceps	Braun	BD527R
1 Needle Holder	Braun	BM201R
1 Bipolar Coagulator	Braun	US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5	S & T	00108
1 Micro Scissors – Straight SAS-11	S & T	00098
1 Micro Scissors – Curved SDC-11	S & T	00090
2 Single Clamps B-3	S & T	00400
2 10/0 nylon suture	S & T	03199
1 6/0 nylon suture	Braun	G2095469
2 4/0 Silk Sutures	Braun	C0760145
Xilocaine 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparin Sodium	Dealmed	272301	5000 UI / ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber	custom made
1 flow-through chamber	custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/mL
Troponin T antibody	Abcam	Ab8295	4 μg/mL
Human-specific Ku80 antibody	Abcam	Ab80592	0.06 μg/mL
Desmin antibody	Dako	M0760	2.55 μg/mL
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells