Myocardinfarct bij pasgeboren muizen, een model van Cardiac Regeneration

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

Myocardiaal infarct geïnduceerd door coronaire ligatie werd gebruikt in vele dierlijke modellen een middel om de mechanismen van cardiale herstel en regeneratie te bestuderen en om nieuwe aangrijpingspunten voor therapeutica. Al tientallen jaren, modellen van complete hart regeneratie bestond in amfibieën en vissen, maar een zoogdier tegenhanger was niet beschikbaar. De recente ontdekking van een postnatale venster waarin muizen bezitten regeneratieve capaciteiten heeft geleid tot de oprichting van een zoogdier model van cardiale regeneratie. Een chirurgische model van zoogdieren hartregeneratie in de neonatale muis wordt hierin gepresenteerd. In het kort, postnatale dag 1 (P1) muizen worden verdoofd door isofluraan en geplaatst op een ijs pad om onderkoeling te veroorzaken. Nadat de borstkas geopend en het linker voorste dalende kransslagader (LAD) wordt gevisualiseerd, wordt een hechting geplaatst rond de LAD myocardiale ischemie toebrengen in de linker ventrikel. De chirurgische procedure duurt 10-15 min. Het visualiseren van de kransslagader wordtcruciaal voor nauwkeurige plaatsing hechtdraad en reproduceerbaarheid. Myocardinfarct en cardiale dysfunctie worden bevestigd door trifenyl-tetrazolium chloride (TTC) kleuring en echocardiografie, respectievelijk. Volledige regeneratie 21 dagen na een myocardinfarct wordt gecontroleerd door histologie. Dit protocol kan worden gebruikt als een instrument om mechanismen van zoogdieren hartregeneratie helderen na myocardiaal infarct.

Introduction

Myocardinfarct (MI) is een belangrijke doodsoorzaak wereldwijd, en blijft verantwoordelijk voor ongeveer eenderde van hartfalen gevallen ^1. Terwijl de komst van percutane interventie en continue optimalisatie van het gebruik van trombolytica toegenomen reperfusie na MI, cardiomyocyt dood en verlies van contractiele myocardium toch optreedt. Er blijven ook grote aantallen "no-optie 'patiënten die geen kandidaat zijn voor of zie niet profiteren van deze interventies. Deze patiënten blijven invaliderende ischemie leidt tot de vorming van schadelijke en ventriculaire remodeling litteken als een mechanisme van infarct healing ervaren. Dit proces leidt uiteindelijk tot hartfalen, waarvoor de prognose slecht, ondanks optimale farmacologische beheer met angiotensine converting enzyme (ACE) remmers en bètablokkers blijft. Helaas, de één-jaar sterftecijfer voor patiënten met een ernstig verminderde linker ventrikel functie nog steeds alsoplopen tot 26% ^2. Harttransplantatie is de laatste behandelingsoptie voor patiënten met hartfalen. Echter, de beperkte donor zwembad voor harttransplantatie niet maken dit een haalbare optie is voor de meeste patiënten. Zo is de ontdekking van nieuwe therapeutische middelen voor de beschadigde hartspier te herstellen blijft cruciaal belang voor het oplossen van het probleem hartziekte. Betrouwbare diermodellen van cardiale schade moeten daarom als een essentieel onderdeel van dit proces.

De traditionele dogma heeft gedicteerd dat volwassen hartspiercellen zijn post-mitotische, terminaal gedifferentieerde cellen, niet in staat om te delen of de-differentiëren om de beschadigde hartspier ³ te vervangen. Als zodanig kan een zoogdier hart volwassene nooit volledig te herstellen van een blessure, en verloren hartspiercellen zouden worden vervangen door vezelig weefsel. Zo heeft onderzoek richtte zich vooral op therapeutische middelen om infarct expansie te minimaliseren en te verminderen littekenvorming. Meer recent heeft echter een paradigmaverschuiving plaatsgevondenin het denken rondom cardiale genezing en vele onderzoeksinspanningen zijn omgeleid om zich te concentreren op het potentieel voor cardiale regeneratie ^4.

Tot voor kort in vivo cardiaal herstel beperkt tot ongewervelde modellen, zoals in Urodela amfibieën en beenvissen ^5-7. De ontdekking van de capaciteit voor cardiale regeneratie in de neonatale muis heeft geleid tot de ontwikkeling van twee chirurgische modellen van zoogdieren hartregeneratie: resectie van de apex cardiale en coronaire occlusie myocardinfarct ^8,9 induceren. In 2011, werd een muis apex resectie model dat wordt gebruikt om aan te tonen dat volledige cardiale regeneratie is mogelijk op postnatale dag 1 (P1). Echter, deze capaciteit daalt snel na de eerste neonatale periode. De zoogdieren hart verliest zijn regeneratieve potentieel kort na de geboorte bij P7 als voorlopercellen cel aantallen dalen, en hartspiercellen raken binucleaire, verliezenhun proliferatieve competentie, en permanent verlaten de celcyclus ^10,11. Inzicht in de fundamentele verschillen tussen de neonatale en volwassen zoogdieren hart kan leiden tot nieuwe inzichten in cardiale regeneratie.

Terwijl apex resectie inderdaad geeft inzicht in hergroei van contractiele weefsel, kan het model niet simuleren typisch menselijke cardiale schade, en dus niet zelf en geven aan de ontwikkeling van therapeutica. De kransslagader occlusie model echter directer simuleert de pathofysiologische aspecten van MI pathologie, en dus kan nuttiger inzichten in de mechanismen die welke voor therapeutische vooruitgang voor menselijk gebruik zijn.

Chirurgische coronaire ligatie werd gebruikt als een bruikbare experimentele techniek in vele dierlijke modellen ^12-14. In de volwassen kransslagader ligatie model worden de dieren verdoofd en geïntubeerd het openen van de borstholte mogelijk behoud respiratiop. Het hart blijft regelmatig te verslaan, waardoor visualisatie van de coronaire vaatstelsel en het toestaan ​​voor een nauwkeurige hechtdraad plaatsing. Bovendien, het hart blijft roze als perfusie blijft, en na ligatie het ischemische myocard verschijnt bleke, wat aangeeft succesvolle kransslagader ligatie. De beschreven neonatale muizen protocol is echter minder betrouwbaar als de kransslagader niet gevisualiseerd en de chirurg moet evalueren wanneer de hechtdraad ¹⁵ te plaatsen. Hoewel de algemene anatomie van de coronaire vasculatuur is hetzelfde, individuele dier variabiliteit richting en vertakking van de LAD bestaat ^16. Dus, als "going blind," de slagader kan gemakkelijk worden gemist. Andere technieken zoals echocardiografie Hierbij moeten succesvolle inductie van MI bevestigen en te garanderen dat alle operaties leiden tot een soortgelijke infarctgrootte. Hier beschreven is een verbetering ten opzichte van een recent gepubliceerde werkwijze ^15, waarbij de positie van de LAD kan worden vastgesteld en derhalve LAD worden geligeerd reproduceerbaar induceren MI.

Deze techniek geen endotracheale intubatie of mechanische ventilatie, zoals thoracotomie in onderkoelde toestand in de neonatale muis vereisen niet tot longcollaps. In de hiervoor beschreven werkwijze, ernstige hypothermie moet worden geïnduceerd tot het punt van zowel complete apnoe en beëindiging van het hartritme ^15. De belangrijkste beperking van deze benadering is dat de kransslagader niet meer doorbloede en het hart wordt bleke nog voordat LAD ligatie. In de aanpak hierin beschreven, kransslagader visualisatie is mogelijk op een punt van de verdoving vóór diepe onderkoeling en hartritme stoppen, met volledig herstel van de neonatale muis na de operatie. Deze methode biedt een groot voordeel van 100% reproduceerbaarheid.

Protocol

Broedparen van C57BL / 6 en CD-1 IG-S muizen werden gekocht van Charles River. Dieren die in deze studie werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en studie protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Gebruik Subcommissie aan Western University, London, Canada. 1. Animal Care Na de geboorte is compleet en pups hebben aanvankelijk borstvoeding door hun moeder voor een paar uur geweest, plaats ze in een andere kooi met een CD-1 ple…

Representative Results

De myocardinfarct procedure bij P1 kan in 10 worden afgerond – 15 min en heeft een sterftecijfer van 7,8% (5 van de 64 pups). Na de operatie, muizen herstellen van onderkoeld verdoving binnen de komende 5-20 min (tijd van herstel is afhankelijk van de lichaamstemperatuur bereikt tijdens de anesthesie en de snelheid van de chirurg). Bij gebruik P7 pups (ter vergelijking met een niet-regeneratieve myocardium), is een langere periode van koeling noodzakelijk om verdoving te bereiken. P7 pup…

Discussion

De chirurgische LAD ligatie hierin gedemonstreerd is een betrouwbare methode om MI produceren neonatale muizen. Dit model biedt onderzoekers met een reproduceerbaar model waarmee zoogdieren hart regeneratie te bestuderen. Visualisatie van de coronaire vasculatuur is een belangrijk onderdeel van deze methode, de correcte plaatsing van hechtdraad en dus het garanderen van de reproduceerbaarheid. Terwijl volwassen muizen niet poikilothermic vermogens bezitten, wordt de lichaamstemperatuur en metabolisme van neonatale muize…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice