El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

El infarto de miocardio inducido por ligadura de la arteria coronaria se ha utilizado en muchos modelos animales como una herramienta para estudiar los mecanismos de la reparación cardíaca y la regeneración, y para definir nuevas dianas para la terapéutica. Durante décadas, los modelos de la regeneración cardíaca completa existían en anfibios y peces, sino un homólogo de mamíferos no estaba disponible. El reciente descubrimiento de una ventana postnatal durante el cual los ratones poseen capacidades regenerativas ha llevado a la creación de un modelo de mamífero de la regeneración cardíaca. Un modelo quirúrgico de la regeneración cardiaca de mamífero en el ratón neonatal se presenta en este documento. En pocas palabras, postnatal día 1 (P1) los ratones se anestesian por isoflurano y se coloca sobre una almohadilla de hielo para inducir la hipotermia. Después se abre el pecho, y la descendente anterior de la arteria coronaria (LAD) se visualiza, una sutura se coloca alrededor de la LAD para causar isquemia de miocardio en el ventrículo izquierdo. El procedimiento quirúrgico tarda 10-15 minutos. La visualización de la arteria coronaria secrucial para colocación de la sutura precisa y reproducibilidad. El infarto de miocardio y disfunción cardíaca se confirman por el cloruro de trifenil-tetrazolio tinción y la ecocardiografía (TTC), respectivamente. regeneración completa 21 días después de un infarto de miocardio es verificada por la histología. Este protocolo se puede utilizar como una herramienta para dilucidar los mecanismos de regeneración cardiaca de mamífero después de un infarto de miocardio.

Introduction

El infarto de miocardio (IM) es la principal causa de muerte en el mundo, y sigue siendo responsable de aproximadamente un tercio de los casos de insuficiencia cardiaca ^1. Mientras que la llegada de la intervención percutánea y optimización continua del uso de trombolíticos ha aumentado la reperfusión después de un IM, la muerte de los cardiomiocitos y la pérdida de miocardio contráctil, sin embargo, ocurre. También queda un gran número de pacientes "sin opción" que no son candidatos para o que no vea los beneficios de estas intervenciones. Estos pacientes continúan experimentando isquemia incapacitantes que conducen a la formación de la cicatriz y el remodelado ventricular perjudicial como un mecanismo de curación del infarto. Este proceso resulta en última instancia, la insuficiencia cardíaca, para los que el pronóstico sigue siendo pobre a pesar del tratamiento farmacológico óptimo con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y los bloqueadores beta. Por desgracia, la tasa de mortalidad a un año en pacientes con función ventricular izquierda severamente dañada todavía permanece comoalto como 26% ^2. El trasplante de corazón es la última opción de tratamiento para los pacientes con insuficiencia cardíaca. Sin embargo, el grupo limitado de donantes para el trasplante de corazón no hacer de esto una opción viable para la mayoría de los pacientes. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos para restaurar el miocardio dañado sigue siendo primordial para resolver el problema de la enfermedad cardíaca. Por lo tanto, se requieren modelos animales fiables de lesión cardíaca como un componente crítico de este proceso.

El dogma tradicional ha dictado que los cardiomiocitos adultos son post-mitótico, terminales células diferenciadas, incapaces de dividir o cierre definitivo de diferenciación para reemplazar el miocardio dañado ^3. Como tal, un corazón de los mamíferos adultos nunca pudo recuperarse completamente de una lesión, y cardiomiocitos perdidos sería reemplazado por tejido fibroso. Por lo tanto, la investigación se ha centrado principalmente en agentes terapéuticos para reducir al mínimo la expansión del infarto y reducir la formación de cicatrices. Sin embargo, más recientemente, se ha producido un cambio de paradigmaen el pensamiento que rodea la cicatrización cardíaca y muchos esfuerzos de investigación se han redirigido a centrarse en el potencial para la regeneración cardiaca ^4.

Hasta hace poco, el estudio in vivo de regeneración cardiaca se restringió a los modelos no de vertebrados, tales como los que en anfibios y peces teleósteos urodelos ^5-7. Sin embargo, el descubrimiento de la capacidad de regeneración cardiaca en el ratón neonatal ha llevado al desarrollo de dos modelos quirúrgicos de la regeneración cardiaca de mamífero: la resección de la oclusión de la arteria coronaria cardiaca ápice y para inducir el infarto de miocardio ^8,9. En 2011, se utilizó un modelo de la resección del ápice del ratón para demostrar que la regeneración cardiaca completa es posible en el día postnatal 1 (P1). Sin embargo, esta capacidad disminuye rápidamente después del período neonatal inicial. El corazón de los mamíferos pierde su potencial regenerativo poco después del nacimiento en P7 como el número de células progenitoras declive, y cardiomiocitos llegar a ser binucleadas, perdersu competencia proliferativa, y permanentemente salen del ^10,11 ciclo celular. La comprensión de las diferencias fundamentales entre el recién nacido y corazón de los mamíferos adultos puede conducir a nuevos conocimientos sobre la regeneración cardiaca.

Si bien la resección del ápice de hecho ofrece una visión de re-crecimiento de tejido contráctil, el modelo no simula una lesión cardiaca humano típico, y por lo tanto no se presta también para el desarrollo de la terapéutica. El modelo de oclusión de la arteria coronaria, sin embargo, simula de forma más directa los aspectos fisiopatológicos de la patología MI, y por lo tanto pueden proporcionar información más útil sobre los mecanismos que pueden ser aplicables al avance terapéutico para uso humano.

Ligadura coronaria quirúrgica se ha utilizado como una técnica experimental útil en muchos modelos animales ^12-14. En el modelo de ligadura de la arteria coronaria de adultos, los animales se anestesiaron y se intubados para permitir la apertura de la cavidad torácica, manteniendo respiratien. El corazón sigue latiendo regularmente, permitiendo la visualización de la vasculatura coronaria y permitiendo la colocación de la sutura precisa. Por otra parte, el corazón sigue siendo de color rosa como la perfusión continua, y después de la ligadura del miocardio isquémico se ve pálido, lo que indica éxito ligadura de la arteria coronaria. El protocolo descrito para ratones recién nacidos, sin embargo, es menos fiable como la arteria coronaria no se visualiza y el cirujano debe estimar dónde colocar la sutura ^15. Aunque la anatomía general de la vasculatura coronaria es el mismo, la variabilidad animal individual en la dirección y la ramificación de la LAD existe ^16. Por lo tanto, cuando "ir a ciegas", la arteria podría perderse fácilmente. entonces se requieren otras técnicas, como la ecocardiografía para confirmar la inducción exitosa de MI, y para asegurar que todas las cirugías como resultado un tamaño del infarto similar. Aquí se describe una mejora en un método recientemente publicado ^15, donde la posición de la LAD Se puede establecercado y por lo tanto LAD se pueden ligar para inducir reproducible MI.

Esta técnica no requiere intubación endotraqueal o ventilación mecánica, como la toracotomía en un estado hipotérmico en el ratón neonatal no resulta en el colapso pulmonar. Sin embargo, en el método anteriormente descrito, la hipotermia severa debe ser inducida hasta el punto de tanto apnea completa y el cese del ritmo cardíaco ^15. La principal limitación de este enfoque es que la arteria coronaria ya no es perfundido y el corazón se ve pálido, incluso antes de la ligadura de LAD. En el enfoque descrito en el presente documento, la visualización de las arterias coronarias es posible en un punto de letargo antes de la hipotermia profunda y la cesación del ritmo cardíaco y la recuperación completa del ratón neonatal después de la cirugía. Este método ofrece una ventaja importante de 100% de reproducibilidad.

Protocol

Las parejas reproductoras de C57BL / 6 y CD-1 IG-S ratones fueron adquiridos de Charles River. Los animales utilizados en este estudio fueron manejados de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, y los protocolos de estudio fueron aprobados por el Subcomité Uso de Animales de la Universidad de Western, Londres, Canadá. 1. Cuidado de Animales Después de dar a luz es completa y crías de haber sido inicialmente amamantado por su madre para unos pocos ho…

Representative Results

El procedimiento de infarto de miocardio en P1 puede ser completado en el 10 – 15 min y tiene una tasa de mortalidad del 7,8% (5 de 64 cachorros). Después de la cirugía, los ratones se recuperan de la anestesia de hipotermia en el próximo de 5 – 20 minutos (tiempo de recuperación depende de la temperatura corporal alcanzado durante la anestesia y la velocidad del cirujano). Cuando se utiliza crías P7 (para la comparación con un miocardio no regenerativa), se requiere un período de…

Discussion

La ligadura de LAD quirúrgico demostrado en el presente documento es un método fiable para producir MI en ratones neonatales. Este modelo proporciona a los investigadores un modelo reproducible con el que para estudiar la regeneración del corazón de los mamíferos. La visualización de la vasculatura coronaria es un componente clave de este método, asegurando la colocación de sutura correcta y garantizando así la reproducibilidad. Mientras que los ratones adultos no poseen capacidades poiquilotermos, la temperatu…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice