Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome
Summary
The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.
Abstract
Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.
Introduction
Prionen sind schwere neurodegenerative Erkrankungen, die das ZNS beeinflussen. Prionenkrankheiten ergeben sich aus der Fehlfaltung des normalen zellulären Prionproteins PrP C, durch einen infektiösen Isomer genannt PrP Res. Diese Krankheiten betreffen eine Vielzahl von Arten , einschließlich der bovinen spongiformen Enzephalopathie bei Rindern, Scrapie bei Schafen, Chronic Wasting Disease bei Hirschartigen, und der Creutzfeldt-Jakob – Krankheit beim Menschen 1-3. Prionen verursachen Neurodegeneration, die mit synaptischen Verlust beginnt, und zu Vakuolisation fortschreitet, Gliose, Neuronenverlust und Plaque-Ablagerungen. Schließlich, was zum Tod des Tieres / Einzel – 4. Seit Jahrzehnten haben Forscher untersuchten Verbindungen gemeint, zu verlangsamen oder das Fortschreiten der Prionenerkrankung stoppen. Allerdings haben die Forscher nicht entweder eine erfolgreiche Therapie oder eine wirksame systemische Abgabe Fahrzeug gefunden.
Endogenes PrP C Expression für die Entwicklung von Prionenkrankheiten notwendigen 5 </sup>. Daher Verringern oder Eliminieren PrP C – Expression in einer Verzögerung oder Linderung von Krankheiten führen kann. Mehrere Gruppen erstellt transgene Mäuse mit reduzierten Mengen an PrP C oder injiziert lentivectors shRNA direkt in murine Hirngewebe exprimiert die Rolle von PrP C – Expressionsniveaus in Prion – Krankheit zu untersuchen. Diese Forscher Verringerung der Menge an neuronaler PrP C gefunden führte die progressive neuropathology von Prion – Erkrankungen in Anhalten und verlängert die Lebensdauer der Tiere 6-9. Wir haben in der Clearance von PrP Res in Maus – Neuroblastomzellen 10 , dass PrP C siRNA Behandlungsergebnisse berichtet. Diese Studien legen nahe , dass die Verwendung von Therapien PrP C Expressionsniveaus, wie small interfering RNA (siRNA), die spaltet mRNA, ausreichend verzögert das Fortschreiten der Prion – Krankheiten können zu verringern. Allerdings sind die meisten Therapien für Prionenerkrankungen untersucht wurden in einer Weise geliefert, die nicht praktikabel wärein einer klinischen Umgebung. Daher muss ein siRNA-Therapie eine systemische Verabreichungssystem, das an das ZNS intravenös und gezielte geliefert wird.
Die Ermittler haben die Verwendung von Liposomen als Abgabevehikel für die Gentherapie Produkte untersucht. Kationische und anionische Lipide zur Bildung von Liposomen verwendet beides. Kationische Lipide sind weiter verbreitet als anionische Lipide verwendet, weil die Ladungsdifferenz zwischen dem kationischen Lipid und DNA / RNA für eine effiziente Verpackung ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von kationischen Lipiden ist , dass sie die Zellmembran leichter als andere Lipide 11-14 kreuzen. Jedoch kationische Lipide sind immunogener als anionische Lipide 13,14. Daher haben begonnen Forscher unter Verwendung von kationischen zu verschieben Lipiden in Liposomen anionische. Die Gentherapie Produkte effizient in anionische Liposomen verpackt werden , um die positiv geladenen Peptid Protaminsulfat verwendet, die DNA kondensiert / RNA – Moleküle 15-19. Da anionische lipids sind weniger immunogen als kationische Lipide sie Zirkulationszeiten zugenommen haben kann, und kann in Tiermodellen 13,14 toleriert werden. Liposome werden auf spezifische Gewebe gezielt Peptide unter Verwendung von Targeting, die an die Liposomen gebunden sind. Die RVG-9R Neuropeptid, das an nikotinische Acetylcholin – Rezeptoren bindet, wurde verwendet, siRNA und Liposomen an das ZNS 17-20 abzuzielen.
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll drei siRNA Fahrzeuge zu produzieren und zu verpacken und die siRNA zu neuronalen Zellen (Abbildung 1) zu liefern. Liposom-siRNA-Peptid-Komplexe (LSPCs) bestehen aus Liposomen mit siRNA und die RVG-9R Peptid elektrostatisch an der äußeren Oberfläche des Liposoms Targeting. Peptid gerichtet Liposomen therapeutische siRNA (PALETS) eingekapselt sind, bestehend aus siRNA und Protamin im Liposom verkapselt, mit RVG-9R zu Lipid PEG-Gruppen kovalent gebunden sind. die folgenden Methoden verwenden LSPCs und PALET zu erzeugenS, PrP C siRNA verringert PrP C Ausdruck zu 90% in neuronalen Zellen auf, die enorme Versprechen hält das Auftreten von Prion – Krankheit Pathologie zu heilen oder erheblich verzögern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, das zwei Systeme zur gezielten Verabreichung zu schaffen, die effizient siRNA zum ZNS transportiert. Frühere Verfahren zur enthalten siRNA zum ZNS Liefern Injizieren siRNA / shRNA Vektoren direkt in das Gehirn, intravenöse Injektion von gezielten siRNA oder intravenöse Injektion von nicht-zielgerichteten Liposomen-siRNA-Komplexe. Injektion von siRNA / shRNA Vektoren in das ZNS verursacht eine Abnahme der Zielprotein-Expressionsniveaus. Jedoch die siRNA / shRNA diffundiert nich…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.
Materials
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2um filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40um Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary – PRC |
Referências
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of ‘intelligent’ liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
